MOLECULAR CLONING, CHARACTERIZATION AND EXPRESSION ANALYSIS OF THE RBM20, A NOVEL RIBONUCLEOPROTEIN GENE ASSOCIATED TO FAMILIAL DILATED CARDIOMYOPATHY.

Lo splicing alternativo del pre-RNA messaggero (pre-mRNA) è un processo strettamente regolato che coinvolge lo spliceosoma e proteine di legame all’RNA che possono reprimere o attivare i siti di splicing selezionati. Oltre il 15% delle malattie genetiche umane sono state associate a mutazioni negli elementi di splicing agenti in cis, ma poche tra queste sono attribuibili a fattori agenti in trans che controllano lo splicing alternativo. Gli effetti di queste mutazioni che coinvolgono il macchinario di splicing basale e i regolatori dello splicing alternativo sono stati associati all’autismo, alla sclerosi laterale amiotrofica e al cancro. Nel cuore e nel muscolo scheletrico, lo splicing alternativo svolge un ruolo critico per la funzione muscolare. In entrambi i sistemi, le transizioni di splicing avvengono secondo delle vie temporali strettamente raggruppate, in cui sono coinvolte le stesse proteine. Un ruolo diretto dei regolatori dello splicing nelle patologie cardiache è stato dimostrato recentemente per due proteine con un motivo di legame all’RNA (RBM), RBM25 e RBM20. Lo studio sperimentale presentato in questa tesi è focalizzato sulla proteina RBM20. RBM20, proteina con un motivo di legame all’RNA di tipo 20, è un fattore agente in trans espresso preferenzialmente nel tessuto cardiaco, che regola lo splicing alternativo di geni aventi un ruolo chiave nella funzionalità cardiaca, compresi quelli che regolano l’omeostasi ionica, la biologia del sarcomero e la trasduzione del segnale. Mutazioni del gene RBM20 sono associate a cardiomiopatia dilatativa familiare e la maggior parte di queste altera i residui amminoacidici presenti nel dominio ricco in arginine e serine della proteina. I motivi funzionali della proteina RBM20 sono stati predetti attraverso l’omologia di sequenza, ma sono stati poco caratterizzati a livello funzionale. In questo studio è stato clonato il cDNA della isoforma cardiaca della proteina RBM20 umana e della corrispondente proteina murina. L’utilizzo di vettori di espressione della proteina RBM20 prodotti nel corso dello studio ha contribuito alla caratterizzazione funzionale dei domini richiesti per la localizzazione nucleare di RBM20. Analisi di microscopia confocale hanno mostrato che RBM20 ha una localizzazione nucleare con distribuzione punteggiata a livello di strutture denominate “nuclear speckles”, questa distribuzione è tipica dei fattori di splicing con un dominio ricco in arginine e serine (RS). Attraverso la produzione di vettori che esprimono forme tronche della proteina e comparando la loro distribuzione subcellulare abbiamo identificato le sequenze necessarie alla localizzazione nucleare di RBM20. Questa regione comprende il dominio di legame all’RNA e il dominio ricco in arginine e serine. La sequenza è conservata in molte specie che appartengono solo alle proteine ortologhe di RBM20. Questi studi dimostrano l’esistenza di una selezione specifica durante l’evoluzione nella regolazione post-trascrizionale del cuore, indicando RBM20 come un fattore chiave negli eventi di regolazione dello splicing richiesti per la funzione cardiaca.

Alternative splicing of pre-messenger RNA is a tightly regulated process that involves the spliceosome and additional RNA binding proteins that can repress or activate splice site selection. More than 15% of human genetic diseases have been associated to mutations in cis-acting splice elements, but very few of them are attributable to trans-factors that control alternative splicing. The effects of these mutations that involve the basal splicing machinery and regulators of alternative splicing have been associated with autism spectrum disorders, amyotrophic lateral sclerosis and cancer. In heart and skeletal muscle, alternative splicing plays a critical role in muscle function. In both systems, splicing transition occurs in tightly grouped temporal ways, partially involving the same proteins. A direct involvement of splicing regulators to cardiac diseases has been proven recently for two RNA binding motif (RBM) protein, the RBM25 and the RBM20. This experimental study is focused on the RBM20 protein. RNA binding motif protein type 20 (RBM20) is a trans-acting factor expressed preferentially in heart tissue, which regulates alternative splicing of gene that have a key role in cardiac function, including ion homeostasis, sarcomere biology and signal transduction. Mutations in the RBM20 gene are linked to familial dilated cardiomyopathy and the most of them alters residues in the arginine-serine domain of the protein. The functional motifs of the RBM20 protein have been predicted by sequence homology, but poorly functionally characterized. In the present study by cloning the cardiac isoform of human RBM20 and the mouse RBM20 full length cDNA I provided functional annotations of structural domains required for the RBM20 nuclear localization. Confocal microscopy analysis showed that RBM20 had a punctuate localization in nuclear speckles, which is typical of RS splicing factors. By producing expressing vectors for truncated proteins and comparing their subcellular distribution we identified the sequences necessary for RBM20 full nuclear retention. The region overlaps both RNA binding motif and arginine-serine domain. The sequence is conserved in many species but belongs only to RBM20 protein orthologs. These studies demonstrate a specific evolutionary selection for post-transcriptional regulation in heart, highlighting RBM20 as a key factor for regulation of splicing events required for cardiac function.