BIOCHEMICAL AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF THE ONCOSUPPRESSOR GENE PROTEIN TYROSINE PHOSPHATASE GAMMA (PTPRG) AND ITS ROLE IN CHRONIC MYELOGENOUS LEUKEMIA

Obiettivi: 1) caratterizzare il ruolo funzionale della proteina PTPRG nella patogenesi della LMC attraverso la ricostruzione molecolare della sua interferenza con la segnalazione di BCR / ABL e 2) studiare la risposta di cellule leucemiche a inibitori tirosin chinasici (TKI) e al dominio intracellulare permeabile di PTPRG (ICD) attraverso la microspettroscopia (microFTIR) all’infrarosso (IR). Storico: la leucemia mieloide cronica (LMC) è una malattia mieloproliferativa del midollo osseo che ha origine dalla traslocazione reciproca bilanciata t (9, 22) (q34, q11). La conseguenza è la generazione molecolare dell’oncogene BCR / ABL che codifica per la proteina chimerica BCR/ABL con attività tirosin chinasica costitutivamente attiva, che porta quindi alla leucemia. Per questa ragione, la nostra attenzione si è focalizzata sui regolatori naturali negativi della segnalazione tirosina chinasica: le proteine tirosine fosfatasi (PTP). Il recettore PTP di tipo gamma (PTPRG) è un membro delle PTPs recettoriali simili. I risultati di studi precedenti effettuati dal nostro gruppo di ricerca aveva già indicato che PTPRG è sottoregolata nella LMC e che può interferire con il segnalazione di BCR / ABL, suggerendo un possibile ruolo della PTPRG nella patogenesi della LMC. Metodi: purificazione di proteine, saggi di pull-down, saggi in vitro di attività fosfatasica, vitalità cellulare, analisi di microscopia confocale, citometria a flusso, immunoprecipitazione e spettroscopia a raggi infrarossi. Risultati: abbiamo applicato la tecnologia di trasduzione proteica usando la tecnologia dei nano vettori troiani TAT, dal clonaggio all'espressione del TAT-fuso con la proteina ricombinante, ossia il dominio intracellulare enzimaticamente attivo (rICD) e il dominio mutante enzimaticamente inattivo rD1028A ICD della proteina PTPRG nei batteri BL-21 di E. Coli. Abbiamo purificato le proteine ricombinanti rICDs-TAT mediante FPLC e testato la loro attività biologica. Nelle linee cellulari è stata raggiunta una elevata efficienza di trasduzione proteica. Abbiamo quindi valutato gli effetti inibitori di queste due proteine purificate rICDs- TAT da sole e in combinazione con l’Imatinib, un inibitore della tirosin chinasi, sulla proliferazione cellulare e sull’apoptosi in una linea cellulare K562 leucemica. Rispetto ai controlli non trattati, è stata osservata una riduzione del 30-40% della vitalità cellulare nei campioni trattati con la proteina rICD-TAT attiva a 1-2 μM. In particolare, non è stato osservato nessun effetto alle stesse concentrazioni della forma enzimaticamente inattiva rD1028A ICD-TAT. Inoltre, i risultati dei saggi di pull-down e coimmunoprecipitazione eseguito con entrambe le proteine purificate, enzimaticamente attiva rICD-TAT e inattiva rD1028A ICD-TAT hanno dimostrato che l’ICD di PTPRG interagisce con le proteine BCR/ABL, Crkl, LYN e RHOA. Infine abbiamo testato la capacità della microspettroscopia all’infrarosso (microFTIR) nell'identificare segni o firme della fosforilazione proteica e dell’apoptosi cellulare di marcatori come TKIs e/o rICDs-TAT in cellule leucemiche . Conclusione: per svelare gli eventi di segnalazione associati al ruolo oncosoppressivo ipotizzato per la PTPRG nella LMC abbiamo usato la tecnologia dei nanovettori permeabili la membrana. La forma enzimaticamente attiva del dominio intracellulare di PTPRG è stato trasdotto in cellule con elevata efficienza. Abbiamo dimostrato che la chinasi LYN potrebbe formare un complesso tripartito con PTPRG, che è in grado di legare e defosforilare BCR / ABL attraverso siti localizzati nel dominio intracellulare. Questi risultati suggeriscono che la PTPRG potrebbe essere un potenziale bersaglio per applicazioni diagnostiche e terapeutiche nella LMC. Infine abbiamo applicato con successo la micro-FTIR come approccio innovativo in grado di identificare le firme molecolari sia di apoptosi che di defosforilazione di proteine in singole cellule minimamente processate, e in campioni non colorati.

Aims: 1) to characterize the functional role of PTPRG in the pathogenesis of CML through the reconstruction of the molecular basis of its interference with BCR/ABL signaling and 2) to study the response of CML cells to tyrosine kinase inhibitors (TKIs) and cell permeable PTPRG intracellular domain (ICD) by infrared (IR) microspectroscopy (microFTIR). Background: Chronic Myelogenous Leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder of the bone marrow that originates from the t(9;22)(q34;q11) balanced reciprocal translocation. The molecular consequence is the generation of the BCR/ABL oncogene that encodes for the chimeric BCR/ABL protein with a constitutively abnormal tyrosine kinase activity, leading to leukemia. For this reason, our attention has been focused on naturally occurring negative regulators of tyrosine kinase signaling: the protein tyrosine phosphatases (PTPs). PTP receptor type gamma (PTPRG) is a member of the receptor-like PTPs. The results of previous studies carried out by our research group had already indicated that PTPRG is down regulated in CML and that it can interfere with BCR/ABL signaling, thus suggesting a possible role for PTPRG in the pathogenesis of CML. Methods: Protein Purification, Pull-down assay, in vitro phosphatase activity assays, Cell viability assay, confocal microscopy, Flow cytometry, Immunoprecipitation, and Infrared spectroscopy. Results: we have applied protein transduction technology based on TAT Trojan nanovector technology, by cloning and expressing TAT- fused with the recombinant, enzymatically active intracellular domain (rICD) and the enzymatically inactive rD1028A ICD mutant domain of PTPRG protein in BL-21 E.Coli. We purified the recombinant rICDs-TAT proteins by FPLC and tested their biological activity. In cell lines high protein transduction rate was achieved. We then evaluated the inhibitory effects of these two purified rICDs-TAT proteins alone and in combination with the tyrosine kinase inhibitor Imatinib on cell proliferation and cell apoptosis in K562 leukemic cell line. As compared to untreated controls, a 30-40% reduction of cell proliferation was observed in samples treated with the active rICD-TAT at 1-2 μM. Notably, no detectable effect was observed with same concentrations of the enzymatically inactive form rD1028A ICD-TAT. Furthermore, the results of pull-down and co-immune precipitation assays performed with both purified enzymatically active rICD-TAT and inactive rD1028A ICD-TAT forms demonstrated that ICD of PTPRG interacts with BCR/ABL, CRKL, LYN, and RHOA. Finally we tested the ability of Fourier Transform (FT) InfraRed (IR) microspectroscopy (microFTIR), a label-free analytical technique, in identifying protein phosphorylation and cell apoptosis signatures as markers of TKIs and/or of rICDs-TAT responses in leukemic cells. Conclusion: To unravel the signaling events associated to the oncosuppressive role hypothesized for PTPRG in CML we used a membrane-permeable nanovector technology. The enzymatically active form of intracellular domain of PTPRG was transduced into the cell with high efficiency. We demonstrated that LYN Kinase might form a tripartite complex with PTPRG, which is able to bind to and dephosphorylate BCR/ABL through binding sites localized in the intracellular domain. These results suggest that PTPRG could be a potential target for diagnostic and therapeutic applications in CML. Finally we successfully applied micro-FTIR as an innovative approach capable to identify molecular signatures of both apoptosis and protein dephosphorylation in individual cells within minimally processed, unstained samples.