Le “fatty acid binding proteins” (FABPs) rappresentano una classe di proteine citosoliche note per essere coinvolte nel meccanismo di trasporto e nell’omeostasi dei lipidi. Queste piccole biomolecole sono infatti responsabili del trasporto di molecole idrofobiche e anfipatiche per via citoplasmatica attraverso la cellula con conseguente liberazione del carico in prossimità della membrana cellulare o di altri componenti cellulari. Nella famiglia delle FABPs, una particolare classe di proteine nota come “bile acid binding proteins” (BABPs) è responsabile del trasporto intracellulare di acidi biliari negli epatociti ed enterociti. Il meccanismo di ricircolo degli acidi biliari tra l’intestino e il fegato è chiamato “circolazione enteroepatica” e assicura il recupero di queste molecole per il successivo riutilizzo. L’alterazione del trasporto intracellulare degli acidi biliari è strettamente collegata a patologie colestatiche con compromissione del flusso biliare e possibilità di sviluppo di forme tumorali a livello epatico. Uno studio approfondito del ruolo delle BABPs nel trasporto intracellulare e dei meccanismi di caricamento e rilascio degli acidi biliari in prossimità delle membrane cellulari, risulta pertanto necessario. Sebbene, in analogia con altre FABPs, l’interazione delle BABPs con la membrana preveda una diretta “collisione”, gli equilibri tra proteina libera e legata alla membrana rimangono poco caratterizzati. Nella prima parte del progetto studi condotti mediante utilizzo della Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) hanno permesso di ottenere informazioni sui dettagli dell’interazione di BABP con sistemi mimetici di membrana. L’impossibilità di una diretta osservazione del complesso proteina-membrana attraverso NMR in soluzione ha inoltre richiesto metodi più avanzati per l’indagine del cosiddetto “stato invisibile”. La conoscenza delle caratteristiche strutturali e di legame degli addotti tra le FABPs e molecole idrofobiche è inoltre alla base dello sviluppo in Risonanza Magnetica per Immagine (MRI) di una nuova classe di agenti di contrasto specifici per il fegato. Oggigiorno, infatti, un crescente interesse è rivolto allo studio di agenti di contrasto tessuto specifici e ad alta rilassività grazie all’interazione con macromolecole. Nella seconda parte del progetto l’interazione tra una proteina di trasporto intracellulare “human-liver FABP” e due differenti potenziali agenti di contrasto funzionalizzati rispettivamente con un acido grasso a catena lunga (AAZTAC17) e un acido biliare (B22626), è stata caratterizzata al fine di aumentare la specificità dell’interazione e la sensibilità di questi potenziali agenti di contrasto. L’affinità di legame delle due molecole per la proteina è stata determinata attraverso misure di rilassometria mentre la localizzazione del sito d’interazione è avvenuta attraverso esperimenti NMR sfruttando le proprietà paramagnetiche di rilassamento del Gd chelate nel complesso. Questi risultati si inseriscono in ambito medico come studi preliminari e potranno servire per lo sviluppo e l’utilizzo in diagnostica di una nuova generazione di agenti di contrasto a base di gadolinio.

The fatty acid binding proteins (FABPs) are a class of cytosolic proteins known to participate in lipid transport and homoeostasis. These relatively small biomolecules are responsible for the translocation of hydrophobic or amphiphilic molecules across the cell, delivering their cargo to the cell membrane or to other cellular components. Some members of the FABP family, called bile acid binding proteins (BABPs), are responsible for the translocation of bile acid (BA) in the enterocytes and in the hepatocytes. This transport is achieved mainly through a protein mediated mechanism that involves BABPs as intracellular carriers. Bile acids undergo a recycling pathway between the intestine and the liver, called “enterohepatic circulation”, which assure the recovery of these molecules and their subsequent reutilization. Alterations of intracellular BA transport are linked to cholestatic diseases and BA accumulation leads to liver damage and may promote the development of liver tumors. A complete understanding of the functional role of BABPs necessitates a detailed description of the mechanisms of ligand uptake from and release to the cell membranes. These mechanisms possibly involve a direct collision of the protein with the membrane, in analogy with other FABP proteins. However, the binding equilibria describing the partitioning of these proteins between free and membrane-bound states remain poorly characterized. In the first part of the project the details the mechanism of interaction of apo BABP with the membrane mimetic systems were investigated via NMR spectroscopy. Despite the system under study prevents a direct investigation of the lipid- bound protein state by solution NMR we applied advance NMR methods for the investigation on the so-called NMR invisible “dark state” of the liposome bound protein. An application of the acquired knowledge on FABPs/lipid interactions has been recently proposed for the development of hepatospecific contrast agents (CAs) for magnetic resonance imaging (MRI). About one-third of MRI clinical scans are carried out in the presence of gadolinium-agents because they add relevant physiological information to the superb anatomical resolution attainable with this technique. There is a growing interest in the development of CAs displaying high tissue specificity and high intrinsic relaxivity obtained with slowly-tumbling molecules binding. In the second part of the project two lipid-functionalized Gd-chelates (AAZTAC17 and B22626) were investigated here for targeting to human liver-fatty acid binding protein (hL-FABP) as a means to increase sensitivity and specificity of intracellular-directed MRI probes. The former consists of a long aliphatic chain bound to the AAZTA coordination cage, the latter has a bile acid-like body linked to the basic unit of DTPA which chelates Gd. The binding affinities of the two selected series of Gd(III) chelates molecules to a liver cytosolic fatty acid transporter, have been determined through relaxivity measurements while the interaction modes and localisation of binding site were characterized performing NMR experiments in solution exploiting the relaxation properties of Gd complexes. These preliminary studies will serve in a medicinal chemistry approach to the design of new Gd-based contrast agents for MRI.

FATTY ACID BINDING PROTEINS (FABPs): SPECTROSCOPIC INTERACTION STUDIES WITH MEMBRANE MIMETICS AND LIPID-FUNCTIONALIZED DRUGS

CECCON, Alberto
2013

Abstract

Le “fatty acid binding proteins” (FABPs) rappresentano una classe di proteine citosoliche note per essere coinvolte nel meccanismo di trasporto e nell’omeostasi dei lipidi. Queste piccole biomolecole sono infatti responsabili del trasporto di molecole idrofobiche e anfipatiche per via citoplasmatica attraverso la cellula con conseguente liberazione del carico in prossimità della membrana cellulare o di altri componenti cellulari. Nella famiglia delle FABPs, una particolare classe di proteine nota come “bile acid binding proteins” (BABPs) è responsabile del trasporto intracellulare di acidi biliari negli epatociti ed enterociti. Il meccanismo di ricircolo degli acidi biliari tra l’intestino e il fegato è chiamato “circolazione enteroepatica” e assicura il recupero di queste molecole per il successivo riutilizzo. L’alterazione del trasporto intracellulare degli acidi biliari è strettamente collegata a patologie colestatiche con compromissione del flusso biliare e possibilità di sviluppo di forme tumorali a livello epatico. Uno studio approfondito del ruolo delle BABPs nel trasporto intracellulare e dei meccanismi di caricamento e rilascio degli acidi biliari in prossimità delle membrane cellulari, risulta pertanto necessario. Sebbene, in analogia con altre FABPs, l’interazione delle BABPs con la membrana preveda una diretta “collisione”, gli equilibri tra proteina libera e legata alla membrana rimangono poco caratterizzati. Nella prima parte del progetto studi condotti mediante utilizzo della Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) hanno permesso di ottenere informazioni sui dettagli dell’interazione di BABP con sistemi mimetici di membrana. L’impossibilità di una diretta osservazione del complesso proteina-membrana attraverso NMR in soluzione ha inoltre richiesto metodi più avanzati per l’indagine del cosiddetto “stato invisibile”. La conoscenza delle caratteristiche strutturali e di legame degli addotti tra le FABPs e molecole idrofobiche è inoltre alla base dello sviluppo in Risonanza Magnetica per Immagine (MRI) di una nuova classe di agenti di contrasto specifici per il fegato. Oggigiorno, infatti, un crescente interesse è rivolto allo studio di agenti di contrasto tessuto specifici e ad alta rilassività grazie all’interazione con macromolecole. Nella seconda parte del progetto l’interazione tra una proteina di trasporto intracellulare “human-liver FABP” e due differenti potenziali agenti di contrasto funzionalizzati rispettivamente con un acido grasso a catena lunga (AAZTAC17) e un acido biliare (B22626), è stata caratterizzata al fine di aumentare la specificità dell’interazione e la sensibilità di questi potenziali agenti di contrasto. L’affinità di legame delle due molecole per la proteina è stata determinata attraverso misure di rilassometria mentre la localizzazione del sito d’interazione è avvenuta attraverso esperimenti NMR sfruttando le proprietà paramagnetiche di rilassamento del Gd chelate nel complesso. Questi risultati si inseriscono in ambito medico come studi preliminari e potranno servire per lo sviluppo e l’utilizzo in diagnostica di una nuova generazione di agenti di contrasto a base di gadolinio.
Protein NMR Spectroscopy; Liposomes; Membrane mimetic systems; MRI contrast agent; Fatty acid binding protein; Peripheral proteins
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