Le cellule staminali neurali sono caratterizzate dall'espressione di nestina e risiedono in regioni specifiche del cervello, in particolare l'ippocampo, la zona subventricolare (SVZ) e il bulbo olfattivo. Altre strutture cerebrali che contribuiscono al corretto sviluppo della corteccia, come le leptomeningi, non sono ancora conosciute contenere cellule staminali. Le leptomeningi, che comprendono l’aracnoide e la pia madre, rivestono tutto il sistema nervoso centrale e sono bagnate da liquido cerebrospinale prodotto dai plessi coroidei. Il nostro gruppo di ricerca ha identificato nelle leptomeningi la presenza di cellule staminali nestina positive. In questo lavoro di tesi si sono caratterizzate le popolazioni cellulari e le componenti della matrice extracellulare che costituiscono il tessuto delle leptomeningi durante lo sviluppo embrionale fino all’età adulta. Utilizzando l’immunofluorescenza in microscopia confocale si è descritta l’organizzazione cellulare delle leptomeningi di ratto agli stadi embrionali di 14 e 20 giorni (E14, E20), postnatale di 0 e 15 giorni (P0, P15) e in età adulta (2 mesi). La quantificazione del numero di cellule staminali nestina positive rileva che durante lo sviluppo si ha una diminuzione progressiva dal 30,6% al 13,1% rispetto al totale delle cellule presenti nella leptomeninge (p<0,05). Inoltre si sono caratterizzate anche le cellule nestina/Ki67-positive (marcatore di proliferazione) e quelle nestina/0ct4-positive (marcatore di selfrenewal). Mediante l’utilizzo della Laser Capture Microscopy è stato possibile confermare l’espressione di geni di staminalità nel tessuto leptomeningeo. In questo studio abbiamo inoltre esaminato i cambiamenti della nicchia dove risiedono le cellule staminali nelle leptomeningi durante lo sviluppo. Abbiamo analizzato la distribuzione di differenti popolazioni cellulari incluse le cellule endoteliali e i periciti. Abbiamo inoltre caratterizzato le componenti della matrice extracellulare come la laminina, e l’eparan solfato che contribuiscono a regolare e a mantenere nello sviluppo la nicchia di cellule staminali. In conclusione in nostri risultati mostrano che le cellule staminali nestina positive sono presenti nelle leptomeningi durante lo sviluppo fino nell’età adulta. Le leptomeningi, quindi sono un tessuto composto da diverse popolazioni cellulari e da componenti della matrice extracelllulare che cotrnibusicono a creare una nicchia favorevole ad ospitare cellule staminali /precursori durante tutto lo sviluppo fino all’età adulta.

Stem cells capable of generating neural differentiated cells are recognized by the expression of nestin and reside in specific regions of the brain, namely hippocampus, subventricular zone (SVZ), and olfactory bulb. For other brain structures, such as leptomeninges, which contribute to the correct cortex development and functions, there is no evidence so far that they may contain stem/precursor cells. Leptomeninges, which include arachnoid and pia mater, cover the entire CNS and are filled with cerebrospinal fluid produced by choroid plexi. They are present since the early embryonic stages of cortical development. In this work we characterize in more details this nestin positive cell population and its niche during development. Confocal immunomicroscopy on rat brain tissue slices was used to describe the cellular organization of the rat leptomeninges at E14, E20, P0, P15 and adulthood. The nestin-positive cell layer is identified since the E20 and is located outside the basal lamina (stained by anti-laminin, marker of basal lamina) in the leptomeningeal compartment. We quantify the number of nestin positive cells in meninges and we observe that they are decreasing from 30,6% to 13,1% during development among the total number. Cluster of proliferating Ki67 - nestin positive cells were found in the leptomeningeal tissue during all developmental stages but they decrease to a lower level in a adult stage. We also analyzed the expression pattern of the self renewal marker Oct4. Clusters of nestin positive cells coexpressing Oct4 were found in all the developmental stages analysed. We further analyzed the expression pattern of other neural stem cells related markers and extracellular matrix components in the leptomeningeal niche. We analyzed the distribution of vimentin, an intermediate filament and marker of neural stem cells. At all stages vimentin-positive cells were observed in leptomeninges. Sox2 was expressed by rare leptomeningeal cells at embryonic stage 14 and 20; we could not observe expression of this stem cell marker by postnatal and adult leptomeningeal cells. DCX (marker of neuroblasts) was abundant in embryonic stages; in postnatal rats we observe rare DCX positive cells expressed in meninges. Expression of GFAP, marker of glia cells was undetectable in leptomeninges at all developmental stages analyzed. Neurotrophin receptor p75 was expressed by cells that are lining pia mater basal lamina layer and mostly not localized with nestin cells.Tuj 1 (neuroblast marker) was present in all developmental stages in brain parenchyma lying underneath basal lamina. Meninges are crossed by vessels and we studied the expression of vascular cell markers. NG2, marker of microvascular pericytes, was expressed at all developmental stages by cells surrounding blood vessels. The endothelial marker CD31 was expressed by cells lining blood vessels. Neither of the two markers were co-expressed by nestin-positive cells. In the niche, nestin positive cells are in tight contact with several extracellular matrix components such as laminin, fibronectin and heparin sulphate which provide proper regulation and maintainence of stem cells. In conclusion we show that the leptomeninges is a putative new neural stem cell niche capable of housing and maintaining up to adulthood a population of stem/progenitor cells (LeSCs) expressing stemness related genes. During development, proliferating and quiescent LeSC are in direct contact with resident niche cells and extracellular matrix molecules, which may provide the proper regulation and maintenance of the stem cell.

Meningeal stem cell niche during development and in adulthood

KUSALO, Marijana
2013

Abstract

Le cellule staminali neurali sono caratterizzate dall'espressione di nestina e risiedono in regioni specifiche del cervello, in particolare l'ippocampo, la zona subventricolare (SVZ) e il bulbo olfattivo. Altre strutture cerebrali che contribuiscono al corretto sviluppo della corteccia, come le leptomeningi, non sono ancora conosciute contenere cellule staminali. Le leptomeningi, che comprendono l’aracnoide e la pia madre, rivestono tutto il sistema nervoso centrale e sono bagnate da liquido cerebrospinale prodotto dai plessi coroidei. Il nostro gruppo di ricerca ha identificato nelle leptomeningi la presenza di cellule staminali nestina positive. In questo lavoro di tesi si sono caratterizzate le popolazioni cellulari e le componenti della matrice extracellulare che costituiscono il tessuto delle leptomeningi durante lo sviluppo embrionale fino all’età adulta. Utilizzando l’immunofluorescenza in microscopia confocale si è descritta l’organizzazione cellulare delle leptomeningi di ratto agli stadi embrionali di 14 e 20 giorni (E14, E20), postnatale di 0 e 15 giorni (P0, P15) e in età adulta (2 mesi). La quantificazione del numero di cellule staminali nestina positive rileva che durante lo sviluppo si ha una diminuzione progressiva dal 30,6% al 13,1% rispetto al totale delle cellule presenti nella leptomeninge (p<0,05). Inoltre si sono caratterizzate anche le cellule nestina/Ki67-positive (marcatore di proliferazione) e quelle nestina/0ct4-positive (marcatore di selfrenewal). Mediante l’utilizzo della Laser Capture Microscopy è stato possibile confermare l’espressione di geni di staminalità nel tessuto leptomeningeo. In questo studio abbiamo inoltre esaminato i cambiamenti della nicchia dove risiedono le cellule staminali nelle leptomeningi durante lo sviluppo. Abbiamo analizzato la distribuzione di differenti popolazioni cellulari incluse le cellule endoteliali e i periciti. Abbiamo inoltre caratterizzato le componenti della matrice extracellulare come la laminina, e l’eparan solfato che contribuiscono a regolare e a mantenere nello sviluppo la nicchia di cellule staminali. In conclusione in nostri risultati mostrano che le cellule staminali nestina positive sono presenti nelle leptomeningi durante lo sviluppo fino nell’età adulta. Le leptomeningi, quindi sono un tessuto composto da diverse popolazioni cellulari e da componenti della matrice extracelllulare che cotrnibusicono a creare una nicchia favorevole ad ospitare cellule staminali /precursori durante tutto lo sviluppo fino all’età adulta.
Meningeal stem cell; development; adulthood
Stem cells capable of generating neural differentiated cells are recognized by the expression of nestin and reside in specific regions of the brain, namely hippocampus, subventricular zone (SVZ), and olfactory bulb. For other brain structures, such as leptomeninges, which contribute to the correct cortex development and functions, there is no evidence so far that they may contain stem/precursor cells. Leptomeninges, which include arachnoid and pia mater, cover the entire CNS and are filled with cerebrospinal fluid produced by choroid plexi. They are present since the early embryonic stages of cortical development. In this work we characterize in more details this nestin positive cell population and its niche during development. Confocal immunomicroscopy on rat brain tissue slices was used to describe the cellular organization of the rat leptomeninges at E14, E20, P0, P15 and adulthood. The nestin-positive cell layer is identified since the E20 and is located outside the basal lamina (stained by anti-laminin, marker of basal lamina) in the leptomeningeal compartment. We quantify the number of nestin positive cells in meninges and we observe that they are decreasing from 30,6% to 13,1% during development among the total number. Cluster of proliferating Ki67 - nestin positive cells were found in the leptomeningeal tissue during all developmental stages but they decrease to a lower level in a adult stage. We also analyzed the expression pattern of the self renewal marker Oct4. Clusters of nestin positive cells coexpressing Oct4 were found in all the developmental stages analysed. We further analyzed the expression pattern of other neural stem cells related markers and extracellular matrix components in the leptomeningeal niche. We analyzed the distribution of vimentin, an intermediate filament and marker of neural stem cells. At all stages vimentin-positive cells were observed in leptomeninges. Sox2 was expressed by rare leptomeningeal cells at embryonic stage 14 and 20; we could not observe expression of this stem cell marker by postnatal and adult leptomeningeal cells. DCX (marker of neuroblasts) was abundant in embryonic stages; in postnatal rats we observe rare DCX positive cells expressed in meninges. Expression of GFAP, marker of glia cells was undetectable in leptomeninges at all developmental stages analyzed. Neurotrophin receptor p75 was expressed by cells that are lining pia mater basal lamina layer and mostly not localized with nestin cells.Tuj 1 (neuroblast marker) was present in all developmental stages in brain parenchyma lying underneath basal lamina. Meninges are crossed by vessels and we studied the expression of vascular cell markers. NG2, marker of microvascular pericytes, was expressed at all developmental stages by cells surrounding blood vessels. The endothelial marker CD31 was expressed by cells lining blood vessels. Neither of the two markers were co-expressed by nestin-positive cells. In the niche, nestin positive cells are in tight contact with several extracellular matrix components such as laminin, fibronectin and heparin sulphate which provide proper regulation and maintainence of stem cells. In conclusion we show that the leptomeninges is a putative new neural stem cell niche capable of housing and maintaining up to adulthood a population of stem/progenitor cells (LeSCs) expressing stemness related genes. During development, proliferating and quiescent LeSC are in direct contact with resident niche cells and extracellular matrix molecules, which may provide the proper regulation and maintenance of the stem cell.
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