Il successo di terapie convenzionali come la chemioterapia e la radioterapia per il trattamento delle neoplasie è stato limitato a causa di diversi fattori come la chemioresistenza ai farmaci e la tossicità periferica causata dalla mancanza di specificità di questi approcci. Per questo motivo l’interesse per le terapie selettive che prevedono l’uso di immunotossine, specialmente per il trattamento di tumori ematologici, è in aumento. Le immunotossine sono proteine chimeriche costituite da un ligando selettivo per la cellula bersaglio (dominio di origine anticorpale, citochina o fattore di crescita) che media il legame e l’internalizzazione della porzione tossica legata chimicamente o fusa geneticamente, generalmente rappresentata da una tossina di origine vegetale o batterica che agisce interferendo con la sintesi proteica. In questo lavoro viene descritta la costruzione di nuove proteine di fusione ad uso terapeutico progettate per indurre apoptosi selettivamente in neoplasie umane dei linfociti B e la valutazione dell’effetto potenziante ottenuto attraverso l’associazione delle immunotossine con farmaci coinvolti in meccanismi metabolici intracellulari. Il dominio di legame delle nostre immunotossine è rappresentato da frammenti anticorpali a singola catena (scFv) diretti verso l’antigene CD38, una molecole di superficie espressa ad alti livelli dai linfociti B di un sottogruppo particolarmente aggressivo di Leucemia Linfatica Cronica (CLL) che evolve in una patologia dall’esito prognostico sfavorevole, nota come Sindome di Richter, e dalle plasmacellule tumorali immature nel Mieloma Multiplo (MM). L’scFv è fuso ad una porzione tossica che agisce inibendo il meccanismo della sintesi proteica negli organismi eucarioti e nel caso delle nostre immunotossine è rappresentato da una forma tronca della Esotossina A prodotta dal batterio Pseudomonas aeruginosa (PE40) o in alternativa dalla tossina di origine vegetale saporina. Abbiamo inizialmente progettato una immunotossina con PE40 ed una con saporina contenenti un scFv derivato da un anticorpo monoclonale (mAb) sviluppato e caratterizzato nel nostro laboratorio. Tutti i costrutti ricombinanti sono stati prodotti nel sistema di espressione di origine batterica Escherichia coli e purificati da corpi di inclusione tramite IMAC. Tuttavia, l’scFv 1E8 non ha consentito di preservare l’efficienza di legame dell’anticorpo parentale. Inoltre, le immunotossine ricombinanti ottenute dalla fusione dell’scFv 1E8 con PE40 o saporina hanno mostrato una bassa affinità di legame nei confronti delle cellule bersaglio esprimenti la molecola CD38 e, di conseguenza, è stata rilavata solo una trascurabile attività citotossica. Con la progettazione della forma divalente dell’scFv 1E8, il nostro scopo è stato quello di aumentare l’affinità di legame dei costrutti. Nonostante i risultati sconfortanti del saggio di legame in citometria a flusso, la molecola DIV1E8-SAP ha dimostrato di inibire la sintesi proteica di cellule CD38-positive con una IC50 nell’ordine del sub-nanomolare. Successivamente abbiamo progettato due immunotossine ricombinanti dirette verso l’antigene CD38, il cui dominio di legame era costituito da un scFv derivato da un mAb con una specificità epitopica diversa da quella del precedentemente descritto 1E8. Le immunotossine AT13/5-PE e AT13/5-SAP hanno dimostrato buone proprietà di legame con una elevata affinità e specificità per l’antigene CD38 espresso sulla superficie di cellule derivate da Linfoma di Burkitt e cellule di mieloma. Abbiamo dimostrato l’abilità si queste immunotossine di inibire la sintesi proteica nelle linee cellulari studiate e ne abbiamo chiaramente dimostrato un effetto dose-risposta. Il blocco della sintesi proteica causato dalle immunotossine derivate da AT13/5 ha determinato infine l’innesco del processo di apoptosi e la morte cellulare. Attraverso saggi di apoptosi abbiamo dimostrato la capacità di AT13/5-PE e AT13/5-SAP di indurre apoptosi in cellule Daudi e RPMI8226. Abbiamo perciò provato che l’associazione delle nostre immunotossine con molecole terapeutiche che agiscono su diversi bersagli dalla cascata di traduzione del segnale coinvolta nella crescita cellulare, nella sopravvivenza e nella proliferazione, potrebbe essere sinergica in alcune linee cellulari. In particolare abbiamo osservato che farmaci coinvolti nell’inibizione di Bcl-2, Bcl-xL e Bcl-w (noti come BH3-mimetics) possono aumentare la potenza delle nostre immunotossine. Abbiamo infine dimostrato una prima prova di concetto riguardo l’efficacia delle immunotossine derivate da AT13/5 su linfociti B derivati da pazienti affetti da CLL, tuttavia questo studio necessita di essere implementato con una casistica più ampia.

The success of conventional chemotherapy and radiotherapy for the treatment of cancer has been limited due to several factors like chemoresistance to drugs and peripheral toxicity caused by the lack of specificity of these approaches. For this reason the interest in targeted therapies using immunotoxins (ITs) especially for the treatment of hematological malignancies is increasing. Immunotoxins are chimeric proteins with a cell-selective ligand (antibody-derived domain, cytokine or growth factor) which drives the binding and internalization of a chemically linked or genetically fused toxic portion, generally represented by a plant or bacterial toxin which acts by interfering with protein synthesis. Here we report on the construction of novel therapeutic fusion proteins designed to induce target antigen-restricted apoptosis in human B-cell neoplasias and the evaluation of the potentiating effect obtained by the association of the ITs with drugs involved in intracellular metabolic pathways. The binding portion of our ITs is represented by a single-chain antibody fragment (scFv) directed against CD38 antigen, a surface molecule highly expressed by B lymphocytes of a particularly aggressive sub-group of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) leading to the prognostically unfavorable Richter’s Syndrome and by the neoplastic immature plasma cells in Multiple Myeloma (MM). The scFv is fused to a toxic portion which acts by inhibiting the mechanism of protein synthesis in eukaryotes and in our ITs is represented by a truncated version of the bacterial toxin Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A (PE40) or alternatively by the plant toxin saporin. We firstly designed a PE40- and a saporin-based IT comprising a scFv derived from a monoclonal antibody (mAb) developed and characterized in our laboratory. All the recombinant constructs were produced in the bacterial expression system E. coli and purified from inclusion bodies by IMAC. However, the scFv format (1E8) did not allow to preserve the binding efficiency of the parental monoclonal. Moreover, the recombinant ITs created by the fusion of 1E8 scFv with PE40 or saporin showed a low binding affinity to the CD38 target cells and, as a consequence, only negligible citotoxic activity was detected. With the creation of the divalent form of the 1E8 scFv, our purpose was to increase the binding affinity of the constructs. Despite the discouraging results of the flow-cytometric binding assay, DIV1E8-SAP demonstrated to inhibit protein synthesis of CD38-positive cells with an IC50 in the sub-nanomolar range. Then we designed two anti-CD38 recombinant ITs whose binding portion was a scFv derived from a mAb with an epitope specificity different from that of the previously described 1E8. AT13/5-PE and AT13/5-SAP showed good binding properties with a high affinity and specificity for CD38 antigen expressed on the surface of Burkitt’s lymphoma cells and myeloma cells. We proved the ability of these ITs to inhibit protein synthesis in the cell lines studied and we clearly demonstrated a dose-response effect of the ITs. The arrest of protein synthesis caused by the AT13/5-derived ITs finally leads to the triggering of the apoptotic cascade and to cell death. By using apoptosis assays we demonstrated the capability of AT13/5-PE and AT13/5-SAP to induce apoptosis of Daudi and RPMI8226 cells. Then we proved that the association of our ITs with therapeutic molecules acting on different targets of the signal transduction cascade involved in cell growth, survival and proliferation, could be synergistic in some cell lines. In particular we observed that drugs involved in the Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibition (BH3-mimetics) can increase the potency of our ITs. Finally we demonstrated a first proof of concept about the efficacy of AT13/5-derived ITs on B-lymphocytes derived from CLL patient, but this study needs to be implemented with a wider number of cases.

Targeting CD38 antigen as a therapeutic strategy for hematological malignancies

CASTAGNA, Monica
2013

Abstract

Il successo di terapie convenzionali come la chemioterapia e la radioterapia per il trattamento delle neoplasie è stato limitato a causa di diversi fattori come la chemioresistenza ai farmaci e la tossicità periferica causata dalla mancanza di specificità di questi approcci. Per questo motivo l’interesse per le terapie selettive che prevedono l’uso di immunotossine, specialmente per il trattamento di tumori ematologici, è in aumento. Le immunotossine sono proteine chimeriche costituite da un ligando selettivo per la cellula bersaglio (dominio di origine anticorpale, citochina o fattore di crescita) che media il legame e l’internalizzazione della porzione tossica legata chimicamente o fusa geneticamente, generalmente rappresentata da una tossina di origine vegetale o batterica che agisce interferendo con la sintesi proteica. In questo lavoro viene descritta la costruzione di nuove proteine di fusione ad uso terapeutico progettate per indurre apoptosi selettivamente in neoplasie umane dei linfociti B e la valutazione dell’effetto potenziante ottenuto attraverso l’associazione delle immunotossine con farmaci coinvolti in meccanismi metabolici intracellulari. Il dominio di legame delle nostre immunotossine è rappresentato da frammenti anticorpali a singola catena (scFv) diretti verso l’antigene CD38, una molecole di superficie espressa ad alti livelli dai linfociti B di un sottogruppo particolarmente aggressivo di Leucemia Linfatica Cronica (CLL) che evolve in una patologia dall’esito prognostico sfavorevole, nota come Sindome di Richter, e dalle plasmacellule tumorali immature nel Mieloma Multiplo (MM). L’scFv è fuso ad una porzione tossica che agisce inibendo il meccanismo della sintesi proteica negli organismi eucarioti e nel caso delle nostre immunotossine è rappresentato da una forma tronca della Esotossina A prodotta dal batterio Pseudomonas aeruginosa (PE40) o in alternativa dalla tossina di origine vegetale saporina. Abbiamo inizialmente progettato una immunotossina con PE40 ed una con saporina contenenti un scFv derivato da un anticorpo monoclonale (mAb) sviluppato e caratterizzato nel nostro laboratorio. Tutti i costrutti ricombinanti sono stati prodotti nel sistema di espressione di origine batterica Escherichia coli e purificati da corpi di inclusione tramite IMAC. Tuttavia, l’scFv 1E8 non ha consentito di preservare l’efficienza di legame dell’anticorpo parentale. Inoltre, le immunotossine ricombinanti ottenute dalla fusione dell’scFv 1E8 con PE40 o saporina hanno mostrato una bassa affinità di legame nei confronti delle cellule bersaglio esprimenti la molecola CD38 e, di conseguenza, è stata rilavata solo una trascurabile attività citotossica. Con la progettazione della forma divalente dell’scFv 1E8, il nostro scopo è stato quello di aumentare l’affinità di legame dei costrutti. Nonostante i risultati sconfortanti del saggio di legame in citometria a flusso, la molecola DIV1E8-SAP ha dimostrato di inibire la sintesi proteica di cellule CD38-positive con una IC50 nell’ordine del sub-nanomolare. Successivamente abbiamo progettato due immunotossine ricombinanti dirette verso l’antigene CD38, il cui dominio di legame era costituito da un scFv derivato da un mAb con una specificità epitopica diversa da quella del precedentemente descritto 1E8. Le immunotossine AT13/5-PE e AT13/5-SAP hanno dimostrato buone proprietà di legame con una elevata affinità e specificità per l’antigene CD38 espresso sulla superficie di cellule derivate da Linfoma di Burkitt e cellule di mieloma. Abbiamo dimostrato l’abilità si queste immunotossine di inibire la sintesi proteica nelle linee cellulari studiate e ne abbiamo chiaramente dimostrato un effetto dose-risposta. Il blocco della sintesi proteica causato dalle immunotossine derivate da AT13/5 ha determinato infine l’innesco del processo di apoptosi e la morte cellulare. Attraverso saggi di apoptosi abbiamo dimostrato la capacità di AT13/5-PE e AT13/5-SAP di indurre apoptosi in cellule Daudi e RPMI8226. Abbiamo perciò provato che l’associazione delle nostre immunotossine con molecole terapeutiche che agiscono su diversi bersagli dalla cascata di traduzione del segnale coinvolta nella crescita cellulare, nella sopravvivenza e nella proliferazione, potrebbe essere sinergica in alcune linee cellulari. In particolare abbiamo osservato che farmaci coinvolti nell’inibizione di Bcl-2, Bcl-xL e Bcl-w (noti come BH3-mimetics) possono aumentare la potenza delle nostre immunotossine. Abbiamo infine dimostrato una prima prova di concetto riguardo l’efficacia delle immunotossine derivate da AT13/5 su linfociti B derivati da pazienti affetti da CLL, tuttavia questo studio necessita di essere implementato con una casistica più ampia.
immunotoxin; targeted therapy of hematological malignancies; tumor antigen; chronic lymphocitic leukemia (CLL)
The success of conventional chemotherapy and radiotherapy for the treatment of cancer has been limited due to several factors like chemoresistance to drugs and peripheral toxicity caused by the lack of specificity of these approaches. For this reason the interest in targeted therapies using immunotoxins (ITs) especially for the treatment of hematological malignancies is increasing. Immunotoxins are chimeric proteins with a cell-selective ligand (antibody-derived domain, cytokine or growth factor) which drives the binding and internalization of a chemically linked or genetically fused toxic portion, generally represented by a plant or bacterial toxin which acts by interfering with protein synthesis. Here we report on the construction of novel therapeutic fusion proteins designed to induce target antigen-restricted apoptosis in human B-cell neoplasias and the evaluation of the potentiating effect obtained by the association of the ITs with drugs involved in intracellular metabolic pathways. The binding portion of our ITs is represented by a single-chain antibody fragment (scFv) directed against CD38 antigen, a surface molecule highly expressed by B lymphocytes of a particularly aggressive sub-group of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) leading to the prognostically unfavorable Richter’s Syndrome and by the neoplastic immature plasma cells in Multiple Myeloma (MM). The scFv is fused to a toxic portion which acts by inhibiting the mechanism of protein synthesis in eukaryotes and in our ITs is represented by a truncated version of the bacterial toxin Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A (PE40) or alternatively by the plant toxin saporin. We firstly designed a PE40- and a saporin-based IT comprising a scFv derived from a monoclonal antibody (mAb) developed and characterized in our laboratory. All the recombinant constructs were produced in the bacterial expression system E. coli and purified from inclusion bodies by IMAC. However, the scFv format (1E8) did not allow to preserve the binding efficiency of the parental monoclonal. Moreover, the recombinant ITs created by the fusion of 1E8 scFv with PE40 or saporin showed a low binding affinity to the CD38 target cells and, as a consequence, only negligible citotoxic activity was detected. With the creation of the divalent form of the 1E8 scFv, our purpose was to increase the binding affinity of the constructs. Despite the discouraging results of the flow-cytometric binding assay, DIV1E8-SAP demonstrated to inhibit protein synthesis of CD38-positive cells with an IC50 in the sub-nanomolar range. Then we designed two anti-CD38 recombinant ITs whose binding portion was a scFv derived from a mAb with an epitope specificity different from that of the previously described 1E8. AT13/5-PE and AT13/5-SAP showed good binding properties with a high affinity and specificity for CD38 antigen expressed on the surface of Burkitt’s lymphoma cells and myeloma cells. We proved the ability of these ITs to inhibit protein synthesis in the cell lines studied and we clearly demonstrated a dose-response effect of the ITs. The arrest of protein synthesis caused by the AT13/5-derived ITs finally leads to the triggering of the apoptotic cascade and to cell death. By using apoptosis assays we demonstrated the capability of AT13/5-PE and AT13/5-SAP to induce apoptosis of Daudi and RPMI8226 cells. Then we proved that the association of our ITs with therapeutic molecules acting on different targets of the signal transduction cascade involved in cell growth, survival and proliferation, could be synergistic in some cell lines. In particular we observed that drugs involved in the Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibition (BH3-mimetics) can increase the potency of our ITs. Finally we demonstrated a first proof of concept about the efficacy of AT13/5-derived ITs on B-lymphocytes derived from CLL patient, but this study needs to be implemented with a wider number of cases.
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