Il fumo di tabacco è la principale causa di morte prevenibile nel mondo industrializzato. L’effetto farmacologico della nicotina gioca un ruolo fondamentale nella dipendenza da fumo di tabacco. La nicotina ha proprietà di rinforzo positivo e negativo, e induce condizionamento operante (comportamento motivato al consumo di nicotina) durante la fase di acquisizione della dipendenza. Vari studi pre-clinici e clinici hanno dimostrato l’importanza di alcuni fattori non farmacologici, come gli stimoli ambientali, nel mantenimento della dipendenza da nicotina e nell’induzione della ricaduta. Questi stimoli inizialmente neutri, ripetutamente associati alla nicotina (es. accendino) assumono un nuovo valore condizionato alla nicotina (CS) attraverso il condizionamento Pavloviano, ed acquisiscono la capacità di indurre “craving” (voglia di fumare) in assenza della droga. Considerata l’importanza delle associazioni CS-nicotina consolidate nella memoria del fumatore nel fenomeno della ricaduta, è stato proposto che trattamenti atti a distruggere le memorie formate ed associate alla nicotina potrebbero agire da pro-astinenti e anti-ricaduta nel trattamento della dipendenza da fumo di tabacco. Dopo una fase di apprendimento le memorie sono immagazzinate tramite un processo chiamato consolidamento. Il condizionamento operante (anche detto strumentale) e il condizionamento pavloviano portano alla formazione di diversi tipi di memorie associate alla droga e responsabili della ricaduta dopo lunga astinenza. Evidenze provenienti da studi sull’animale e sull’uomo dimostrano che le memorie, una volta richiamate/riattivate, tornano in uno stato labile durante il quale possono venire aggiornate e reimmagazzinate oppure distrutte. Il richiamo delle memorie dunque le destabilizza ed innesca un fenomeno detto di riconsolidamento necessario affinchè la memoria venga mantenuta. Vi è una certa evidenza che le memorie pavloviane possano subire riattivazione e riconsolidamento ed è stato proposto che trattamenti che intervengono per distruggere il riconsolidamento di queste memorie possono rendersi utili nella inibizione delle memorie associate alla paura e anche delle memorie associate alle droghe. La distruzione delle memorie associate alle droghe è stato proposto come potenziale trattamento per prevenire la ricaduta al consumo di droga indotta dai CS nei tossicodipendenti. Molti studi condotti nell’animale da laboratorio hanno dimostrato che il riconsolidamento delle memorie associate alle droghe può essere prevenuto attraverso la somministrazione di farmaci amnesici, che agiscono a specifici livelli molecolari (es., sistema adrenergico e glutamatergico), prima o dopo la loro riattivazione. Ad oggi non è ancora chiaro se tutte le memorie, o solo alcune, possono essere riattivate e riconsolidate. Ad esempio la possibilità che la memoria strumentale possa essere riattivata e riconsolidata o distrutta è ancora molto discussa ed esperimenti comportamentali volti a studiare la pura memoria strumentale potrebbero chiarire questa questione. Lo scopo di questo lavoro di tesi era di studiare se fosse possibile distruggere le memorie pavloviane e strumentali associate alla nicotina somministrando propranololo, antagonista del recettore β-adrenergico, o MK-801, antagonista del recettore N-methyl-d-aspartato (NMDARs). Inoltre abbiamo verificato la possibilità di utilizzare la tecnica dell’immunoistochimica per determinare il livello di espressione di Zif268, un marker molecolare specificamente coinvolto nel riconsolidamento della memoria, dopo la riattivazione di memorie pavloviane associate alla nicotina nel ratto. E’ stato utilizzato il modello di laboratorio della autosomministrazione di nicotina, basato sul paradigma del condizionamento operante e pavloviano, alla nicotina e ai CS associati alla nicotina. Abbiamo condotto due studi nei quali il trattamento farmacologico (propranololo o MK-801) veniva somministrato prima o dopo la riattivazione delle memorie pavloviane o strumentali associate alla nicotina. Abbiamo quindi testato l’effetto del trattamento farmacologico sulla ricaduta al comportamento di ricerca di nicotina. La riattivazione della memoria pavloviana è consistita nella presentazione dei CS in assenza della nicotina. La riattivazione della memoria strumentale è consistita nel permettere all’animale di premere la leva precedentemente associata all’infusione di nicotina, senza che la nicotina venisse somministrata. Abbiamo inoltre effettuato un esperimento di immunoistochimica su fettine di cervello di ratto per determinare l’espressione di Zif268 in amigdala basolaterale, regione maggiormente coinvolta nel risonsolidamento della memoria, dopo la presentazione dei CS associati alla nicotina. I risultati hanno dimostrato che il propranololo somministrato dopo la riattivazione della memoria pavloviana associata alla nicotina (30 CS) non è stato in grado di prevenire la ricaduta al comportamento di ricerca di nicotina. Un’ipotesi plausibile potrebbe essere che la memoria strumentale ancora presente non possa essere riattivata e riconsolidata, e quindi non possa essere nemmeno distrutta. Per verificare questa ipotesi abbiamo testato l’effetto dell’MK-801, dimostrato essere più efficace nella distruzione del riconsolidamento di diversi tipi di memoria, somministrato 30 minuti prima della riattivazione della memoria strumentale. I risultati hanno dimostrato che la somministrazione di MK-801 prima della riattivazione non previene la ricaduta al comportamento di ricerca di nicotina. Questi dati suggeriscono una prevenzione della destabilizzazione della memoria strumentale, che la blocca in una fase stabile, piuttosto che una distruzione del riconsolidamento. Un altro studio in cui MK-801 è stato somministrato dopo che la destabilizzazione della memoria strumentale ha avuto luogo (es., somministrato dopo la sessione di riattivazione) ha dimostrato che MK-801 è stato in grado di prevenire la ricaduta al comportamento di ricerca di nicotina. Infine l’immunoistochimica ha consentito di individuare un aumento del livello di espresione di Zif268 in amigdala basolaterale nei ratti sottoposti a riattivazione della memoria pavloviana associata alla nicotina. Questi dati confermano la validità della tecnica nella determinazione dell’espressione di markers molecolari specificamente coinvolti nel riconsolidamento della memoria. In conclusione, i nostri dati suggeriscono che: i) propranololo non distrugge il riconsolidamento della memoria pavloviana associata alla nicotina nelle nostre condizioni, ii) MK-801 somministrato prima della riattivazione potrebbe prevenire la destabilizzazione della memoria strumentale associata alla nicotina ma non ne distrugge il riconsolidatemnto nelle nostre condizioni, iii) MK-801 somministrato dopo la riattivazione della memoria strumentale associata alla nicotina ne distrugge il riconsolidamento nelle nostre condizioni, iiii) l’immunoistochimica è una tecnica adatta ad investigare l’espressione di markers molecolari specifiamente coinvolti nel riconsolidamento della memoria come Zif268, e potrà dunque essere utilizzata per dimostrare direttamente il riconsolidamento della memoria e suppoortare i risultati degli esperimenti comportamentali. Questi dati suggeriscono che la memoria strumentale potrebbe essere responsabile della mancanza di effetto di alcuni trattamenti farmacologici anti-ricaduta e che comunque questo tipo di memoria può essere distrutta se contrastata opportunamente. Lo sviluppo di nuovi farmaci capaci di agire a livello dei diversi meccanismi molecolari che sottostanno ai differenti tipi di memorie associate alle droghe potrebbere consentire una terapia coadiuvante alle attuali terapie anti-fumo e anti-ricaduta in grado di garantire una astinenza a lungo termine agli ex fumatori.

Tobacco use through cigarette smoking is the leading preventable cause of death in the developed world. The pharmacological effect of nicotine plays a crucial role in tobacco addiction. Nicotine is positively and negatively reinforcing and leads to the development of “operant conditioning” (motivated behaviour to nicotine consumption) in smokers during the acquisition phase of addiction. Several preclinical and clinical studies have also underlined the importance of non-pharmacological factors, such as environmental stimuli, in maintaining smoking behaviour and promoting relapse. Initially neutral stimuli that are repeatedly paired with a reinforcing drug (e.g. lighter) acquire a new conditioned value (conditioned stimuli, CS) through “Pavlovian conditioning” and become able to elicit craving even in the absence of the drug. Given the importance of the learned association between stimuli and nicotine in the phenomenon of relapse to nicotine-seeking behaviour, it has been proposed that treatment that disrupts the nicotine-associated memories could act as a pro-abstinent and anti-relapse therapy. After learning experience, memories are stored by a process called consolidation. Operant conditioning (also called instrumental learning) and Pavlovian conditioning lead to different drug-related memories formation (instrumental memories and Pavlovian memories) responsible for the relapse even after prolonged abstinence. However converging evidence from animal and human studies have revealed that memories may return to a vulnerable phase during which they can be updated, maintained and even disrupted. The retrieval of a memory indeed may destabilize the consolidated memory that requires a new process to be maintained. This hypothetical process is called reconsolidation. There is strong evidence that Pavlovian fear memories undergo reconsolidation and it was proposed that interventions to disrupt reconsolidation may help for specific and selective inhibition of fear related memories and, similarly, appetitive memories (i.e., for drug addiction). The disruption of drug-related memories reconsolidation has been proposed as a potential therapeutic target to prevent the CS-induced relapse in ex drug-addicts. Several animal studies have shown that the reconsolidation of some drug-related memories can be disrupted by the administration of an amnestic drug contingently upon retrieval of the memory acting at specific molecular levels (i.e. adrenergic and glutamatergic systems). However it is not known if all memories or only certain kind of memories could be retrieved and reconsolidated or disrupted. To date reconsolidation of instrumental memories is still under discussion and behavioural experiments targeting the pure instrumental memory reconsolidation disruption are needed to clarify this issue. The main objective of the present thesis was to study if it is possible to disrupt Pavlovian and instrumental nicotine-related memories reconsolidation by β-adrenergic receptor antagonist propranolol, or N-methyl-d-aspartate receptors (NMDARs) antagonist MK-801 respectively. We also verified the feasibility and reliability of Zif268 (a specific marker of memory reconsolidation) expression assessment by immunohistochemistry after retrieval of Palovian memory in rodents. The experimental approach used to address this issue was the laboratory model of nicotine self-administration in rats, based on the paradigms of operant and Pavlovian conditioning to nicotine and nicotine-associated cues. We performed two studies in which the pharmacological treatment (propranolol or MK-801) was associated to retrieval of Pavlovian or instrumental nicotine-related memories. We therefore assessed the effect of these pharmacological treatments on relapse to nicotine seeking behaviour. Retrieval of Pavlovian memories consists in presenting the CS in the absence of US. Retrieval of instrumental memories consists in allowing the animal to press the lever previously paired to nicotine reinforcement, without nicotine infusion. We also performed an immunohistochemistry assay in which the Zif268 level of expression was determined in basolateral amygdala (the most important region involved in memory reconsolidation) after nicotine CS presentation. Results showed that propranolol given after retrieval of Pavlovian memories (30 CS presentations) did not reduce the relapse to nicotine seeking behaviour compared to control groups that received vehicle injection in both retrieved or no-retrieved groups. It could be possible that instrumental memories, still present, do not undergo reconsolidation and could not be disrupted. To address this issue we tested the effect of MK-801, known to be more effective against instrumental memory than propranolol, given 30 minutes before the retrieval of instrumental memories. Results showed that pre-retrieval MK-801 injection did not prevent the relapse to nicotine-seeking behaviour when compared to control groups. This effect suggests a potential role of MK-801 in inhibition of the memory destabilization process instead of reconsolidation disruption. Further experiments in which MK-801 was given after memory destabilization was engaged (i.e. given after memory retrieval) showed that MK-801 prevented the relapse to nicotine-seeking behaviour. Finally immunohistochemistry showed an increased level of Zif268 expression in basolateral amygdala after retrieval of Pavlovian nicotine-related memories. These data confirm the validity and feasibility of immunohistochemistry to assess the expression of molecular markers correlating reconsolidation such as Zif268 after memory retrieval. In conclusion, our findings suggest that: i) propranolol did not disrupt Pavlovian memory reconsolidation in our conditions, ii) MK-801 given prior to retrieval session could prevent instrumental memory destabilization, but did not disrupt memory reconsolidation in our conditions, iii) MK-801 given after retrieval session disrupted memory reconsolidation in our conditions, iiii) immunohistochemistry is a feasible technique to investigate the expression of molecular markers correlating reconsolidation such as Zif268, thus it can be used to support our future behavioural studies. These data suggest that instrumental memory could be responsible for the lack of effect of some anti-relapse pharmacological treatments and that this kind of memory can be disrupted. New and specific pharmacological intervention, acting at specific molecular mechanisms that underlies reconsolidation of different kind of memories (i.e. Pavlovian but also instrumental memories), could be used as a potential co-adjuvant to current therapeutic interventions for smoking cessation and abstinence maintenance.

MOLECULAR AND CELLULAR MECHANISMS UNDERLYING COGNITIVE NEUROADAPTATION IN ADDICTION: AN IN VIVO-VITRO INTEGRATIVE APPROACH

TEDESCO, Vincenzo
2013

Abstract

Il fumo di tabacco è la principale causa di morte prevenibile nel mondo industrializzato. L’effetto farmacologico della nicotina gioca un ruolo fondamentale nella dipendenza da fumo di tabacco. La nicotina ha proprietà di rinforzo positivo e negativo, e induce condizionamento operante (comportamento motivato al consumo di nicotina) durante la fase di acquisizione della dipendenza. Vari studi pre-clinici e clinici hanno dimostrato l’importanza di alcuni fattori non farmacologici, come gli stimoli ambientali, nel mantenimento della dipendenza da nicotina e nell’induzione della ricaduta. Questi stimoli inizialmente neutri, ripetutamente associati alla nicotina (es. accendino) assumono un nuovo valore condizionato alla nicotina (CS) attraverso il condizionamento Pavloviano, ed acquisiscono la capacità di indurre “craving” (voglia di fumare) in assenza della droga. Considerata l’importanza delle associazioni CS-nicotina consolidate nella memoria del fumatore nel fenomeno della ricaduta, è stato proposto che trattamenti atti a distruggere le memorie formate ed associate alla nicotina potrebbero agire da pro-astinenti e anti-ricaduta nel trattamento della dipendenza da fumo di tabacco. Dopo una fase di apprendimento le memorie sono immagazzinate tramite un processo chiamato consolidamento. Il condizionamento operante (anche detto strumentale) e il condizionamento pavloviano portano alla formazione di diversi tipi di memorie associate alla droga e responsabili della ricaduta dopo lunga astinenza. Evidenze provenienti da studi sull’animale e sull’uomo dimostrano che le memorie, una volta richiamate/riattivate, tornano in uno stato labile durante il quale possono venire aggiornate e reimmagazzinate oppure distrutte. Il richiamo delle memorie dunque le destabilizza ed innesca un fenomeno detto di riconsolidamento necessario affinchè la memoria venga mantenuta. Vi è una certa evidenza che le memorie pavloviane possano subire riattivazione e riconsolidamento ed è stato proposto che trattamenti che intervengono per distruggere il riconsolidamento di queste memorie possono rendersi utili nella inibizione delle memorie associate alla paura e anche delle memorie associate alle droghe. La distruzione delle memorie associate alle droghe è stato proposto come potenziale trattamento per prevenire la ricaduta al consumo di droga indotta dai CS nei tossicodipendenti. Molti studi condotti nell’animale da laboratorio hanno dimostrato che il riconsolidamento delle memorie associate alle droghe può essere prevenuto attraverso la somministrazione di farmaci amnesici, che agiscono a specifici livelli molecolari (es., sistema adrenergico e glutamatergico), prima o dopo la loro riattivazione. Ad oggi non è ancora chiaro se tutte le memorie, o solo alcune, possono essere riattivate e riconsolidate. Ad esempio la possibilità che la memoria strumentale possa essere riattivata e riconsolidata o distrutta è ancora molto discussa ed esperimenti comportamentali volti a studiare la pura memoria strumentale potrebbero chiarire questa questione. Lo scopo di questo lavoro di tesi era di studiare se fosse possibile distruggere le memorie pavloviane e strumentali associate alla nicotina somministrando propranololo, antagonista del recettore β-adrenergico, o MK-801, antagonista del recettore N-methyl-d-aspartato (NMDARs). Inoltre abbiamo verificato la possibilità di utilizzare la tecnica dell’immunoistochimica per determinare il livello di espressione di Zif268, un marker molecolare specificamente coinvolto nel riconsolidamento della memoria, dopo la riattivazione di memorie pavloviane associate alla nicotina nel ratto. E’ stato utilizzato il modello di laboratorio della autosomministrazione di nicotina, basato sul paradigma del condizionamento operante e pavloviano, alla nicotina e ai CS associati alla nicotina. Abbiamo condotto due studi nei quali il trattamento farmacologico (propranololo o MK-801) veniva somministrato prima o dopo la riattivazione delle memorie pavloviane o strumentali associate alla nicotina. Abbiamo quindi testato l’effetto del trattamento farmacologico sulla ricaduta al comportamento di ricerca di nicotina. La riattivazione della memoria pavloviana è consistita nella presentazione dei CS in assenza della nicotina. La riattivazione della memoria strumentale è consistita nel permettere all’animale di premere la leva precedentemente associata all’infusione di nicotina, senza che la nicotina venisse somministrata. Abbiamo inoltre effettuato un esperimento di immunoistochimica su fettine di cervello di ratto per determinare l’espressione di Zif268 in amigdala basolaterale, regione maggiormente coinvolta nel risonsolidamento della memoria, dopo la presentazione dei CS associati alla nicotina. I risultati hanno dimostrato che il propranololo somministrato dopo la riattivazione della memoria pavloviana associata alla nicotina (30 CS) non è stato in grado di prevenire la ricaduta al comportamento di ricerca di nicotina. Un’ipotesi plausibile potrebbe essere che la memoria strumentale ancora presente non possa essere riattivata e riconsolidata, e quindi non possa essere nemmeno distrutta. Per verificare questa ipotesi abbiamo testato l’effetto dell’MK-801, dimostrato essere più efficace nella distruzione del riconsolidamento di diversi tipi di memoria, somministrato 30 minuti prima della riattivazione della memoria strumentale. I risultati hanno dimostrato che la somministrazione di MK-801 prima della riattivazione non previene la ricaduta al comportamento di ricerca di nicotina. Questi dati suggeriscono una prevenzione della destabilizzazione della memoria strumentale, che la blocca in una fase stabile, piuttosto che una distruzione del riconsolidamento. Un altro studio in cui MK-801 è stato somministrato dopo che la destabilizzazione della memoria strumentale ha avuto luogo (es., somministrato dopo la sessione di riattivazione) ha dimostrato che MK-801 è stato in grado di prevenire la ricaduta al comportamento di ricerca di nicotina. Infine l’immunoistochimica ha consentito di individuare un aumento del livello di espresione di Zif268 in amigdala basolaterale nei ratti sottoposti a riattivazione della memoria pavloviana associata alla nicotina. Questi dati confermano la validità della tecnica nella determinazione dell’espressione di markers molecolari specificamente coinvolti nel riconsolidamento della memoria. In conclusione, i nostri dati suggeriscono che: i) propranololo non distrugge il riconsolidamento della memoria pavloviana associata alla nicotina nelle nostre condizioni, ii) MK-801 somministrato prima della riattivazione potrebbe prevenire la destabilizzazione della memoria strumentale associata alla nicotina ma non ne distrugge il riconsolidatemnto nelle nostre condizioni, iii) MK-801 somministrato dopo la riattivazione della memoria strumentale associata alla nicotina ne distrugge il riconsolidamento nelle nostre condizioni, iiii) l’immunoistochimica è una tecnica adatta ad investigare l’espressione di markers molecolari specifiamente coinvolti nel riconsolidamento della memoria come Zif268, e potrà dunque essere utilizzata per dimostrare direttamente il riconsolidamento della memoria e suppoortare i risultati degli esperimenti comportamentali. Questi dati suggeriscono che la memoria strumentale potrebbe essere responsabile della mancanza di effetto di alcuni trattamenti farmacologici anti-ricaduta e che comunque questo tipo di memoria può essere distrutta se contrastata opportunamente. Lo sviluppo di nuovi farmaci capaci di agire a livello dei diversi meccanismi molecolari che sottostanno ai differenti tipi di memorie associate alle droghe potrebbere consentire una terapia coadiuvante alle attuali terapie anti-fumo e anti-ricaduta in grado di garantire una astinenza a lungo termine agli ex fumatori.
Drug addiction; nicotine; relapse; memory reconsolidation
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