Modulation of lipopolysaccharide-induced gene transcription by IL-10: focus on transcription factors and chromatin modifications.

Il processo infiammatorio è costituito dalla successione temporale di eventi coordinati dalla presenza di distinte citochine pro- e antinfiammatorie. Il mancato controllo temporale e/o dell'entità della risposta infiammatoria può svolgere un ruolo importante nello sviluppo di patologie infiammatorie croniche e autoimmuni. In questo contesto, la corretta evoluzione dell’infiammazione, finalizzata all’eliminazione di agenti patogeni senza generare danno ai tessuti, è fortemente condizionata dai livelli relativi di citochine pro- e antiinfiammatorie. Per questo la caratterizzazione delle vie di trasduzione del segnale che regolano l’espressione dei geni codificanti per citochine durante l’infiammazione è di particolare importanza, ed ha rilevanti ricadute traslazionali. L’entità e la durata della risposta infiammatoria sono finemente regolate dall’ Interleuchina (IL)-10, una potente citochina antinfiammatoria, in grado di limitare l’espressione e la produzione di citochine e chemochine proinfiammatorie e di promuovere il rilascio di molecole antinfiammatorie da monociti, macrofagi e neutrofili attivati in seguito a stimolazione dei recettori Toll-like (TLRs), come il lipopolisaccaride (LPS) batterico. Nonostante l’IL-10 sia una citochina molto studiata per le sue attività antinfiammatorie ed immunomodulatorie, il meccanismo molecolare attraverso cui esercita le sue azioni biologiche è ancora controverso. Lo scopo di questa tesi è quello di caratterizzare i meccanismi molecolari attraverso i quali l’IL-10 modula l’espressione di citochine infiammatorie in monociti e neutrofili umani attivati dall’LPS. In particolare lo studio si è articolato in modo da perseguire due obiettivi principali: (A) Caratterizzazione dei meccanismi molecolari attraverso cui IL-10 potenzia la trascrizione del mediatore anti-infiammatoria antagonista del recettore per Interleuchina 1 (IL-1ra) indotta da LPS; (B) Caratterizzazione dei meccanismi molecolari attraverso cui IL-10 inibisce la trascrizione di due mediatori proinfiammatori indotti da LPS, la chemochina CXCL8 e la citochina TNF-a pro-infiammatorie indotte da LPS. (A) I nostri risultati dimostrano che nei monociti e neutrofili stimolati con LPS, NF-kBp65 e NF-kBp50 traslocano nel nucleo e vengono reclutati sul promotore di geni NF-kB-dipendenti (come ad es. IkBa), ma non sul promotore di IL-1ra, nonostante questo possieda dei siti funzionali di legame per NF-kB. Tale reclutamento diviene efficiente solo in presenza di IL-10. Infatti, IL-10, promuovendo l’acetilazione della cromatina a livello del promotore di IL-1ra, smaschera i siti di legame favorendo così il reclutamento di NF-kBp65 e NF-kBp50. Questo processo è strettamente dipendente dall’attivazione di STAT3 da parte dell’IL-10, come dimostrato in neutrofili purificati da pazienti affetti da hyper IgE (HIES) che hanno uno STAT3 non funzionale. In queste cellule, la mancata attivazione di STAT3 da parte dell’IL-10 impedisce sia l’induzione del reclutamento di NF-kBp65 e NF-kBp50 sul promotore di IL-1ra che il potenziamento della trascrizione di questo gene. Il nostro studio descrive per la prima volta come IL-10, utilizzando un meccanismo che modifica la struttura della cromatina, moduli l’espressione di IL-1ra indotta da LPS in monociti e neutrofili umani. La rilevanza di tale meccanismo è supportata dalle osservazioni fatte in pazienti HIES, in cui la difettosa attivazione di STAT3 indotta da IL-10 è responsabile di una risposta immunitaria innata eccessiva. (B) Nella seconda parte della tesi abbiamo analizzato i meccanismi molecolari attraverso cui l’ IL-10 inibisce l’espressione di citochine pro-infiammatorie indotta da LPS. Lo studio è focalizzato su due classici ed importanti mediatori proinfiammatori: la chemochina CXCL8 e la citochina TNF-a. I dati ottenuti indicano che IL-10 utilizza meccanismi diversi e cellulo-specifici per inibire la trascrizione di CXCL8 e TNF-a indotta da LPS. Infatti, IL-10 inibisce direttamente il reclutamento della Polimerasi II (Pol II), indotto da LPS, sui promotori di CXCL8 e TNF-a nei neutrofili, ma non nei monociti. La riduzione del reclutamento della Pol II nei neutrofili correla con la riduzione dei livelli di c-fos reclutati in seguito a stimolazione con LPS sui promotori di CXCL8 e TNF-a. Questa osservazione suggerisce che i due eventi siano causalmente correlati. Al contrario, nei monociti, IL-10 inibisce il reclutamento dalla ciclina chinasi 9 (CDK9) e di conseguenza l’attivazione (cioè la fosforilazione in Serina-2) della Pol II legata ai promotori, inibendo in questo modo l’allungamento del trascritto. L’inibizione del reclutamento della CDK9 avviene con modalità diverse per ciascun promotore. Infatti, nel caso del promotore di CXCL8, l’IL-10, probabilmente attraverso il reclutamento e/o attivazione di una istone-deacetilasi (HDAC), riduce i livelli di acetilazione dell’istone H4 associato al promotore di CXCL8. Questa riduzione determina un mancato reclutamento di Brd4 e, di conseguenza, di CDK9. Nel caso del TNF-a, invece, l’inibizione del reclutamento di CDK9 è probabilmente dovuta all’inibizione del reclutamento di c-Jun indotto dall’LPS. Complessivamente, questi dati portano alla luce un nuovo meccanismo utilizzato da IL-10 per inibire la trascrizione di CXCL8 e TNF-a.

The inflammatory process consists of a coordinated, sequential and self-limiting release of different mediators that orchestrate and control the chronological phases of leukocytes recruitment, activation, and clearance. In this contest, it is well known that the appropriate balance between pro- and anti-inflammatory cytokines production and action is essential for successful innate immune response that clears infectious pathogens but limits tissue damage and autoimmunity. The characterization of the pathways and checkpoints that regulate cytokine gene expression during physiologic inflammation is of particular importance, since it will yield insights into fundamental events occurring in disorders characterized by deregulated inflammation. The amplitude and the duration of the inflammatory response are fine-tuned by Interleukin (IL)-10, a potent antinflammatory cytokine produced, among others, by myeloid cells in response to Toll-like receptor (TLR) activation and, in turn, very effective at suppressing TLR-induced gene expression and inflammatory cytokine production. Although IL-10 antinflammatory properties have been thoroughly described, the molecular mechanisms governing IL-10 production and actions on cells of the innate immune system have not been fully elucidated yet. The purpose of the thesis is to provide a comprehensive characterization of the molecular mechanisms through which IL-10 modulates inflammatory cytokine gene expression in human monocytes and neutrophils exposed to lipopolysaccharide (LPS). In particular, the study is focused on two main goals: (A) characterization of the molecular mechanisms through which IL-10 potentiate the transcription of the LPS-induced anti-inflammatory mediator, the Interleukin 1 receptor antagonist (IL-1ra); (B) characterization of the molecular mechanisms through which IL-10 inhibits the LPS-induced transcription of two pro-inflammatory mediators, a chemokine, CXCL8 and a cytokine, TNF-a. (A) Our results show that in monocytes and neutrophils while NF-kBp65 and NF-kBp50 proteins accumulate into the nuclei and bind to the promoter of IkBa during LPS stimulation, they are not recruited to the kB sites of the IL-1ra promoter. However, in the presence of LPS plus IL-10, which we found to induce chromatin acetylation, recruitment of both NF-kBp65 and NF-kBp50 to the IL-1ra promoter efficiently occurs in a STAT3-dependent manner. Accordingly, a failure of IL-10 to promote NF-kBp65 recruitment to the IL-1ra promoter, and consequently to potentiate LPS-induced IL-1ra transcription, was observed in neutrophils from hyper IgE syndrome (HIES) patients, who carry a non-functional STAT3. Our study uncovers a gene-specific targeting of chromatin structure as a previously undescribed mechanisms used by IL-10 to modulate LPS-induced IL-1ra expression in human monocytes and neutrophils. The relevance of such mechanism is supported by the observations made in HIES patients, in whom the defective IL-10-induced activation of STAT3 is responsible for an overly activated innate immune responses. (B) In the second part of the thesis we addressed the question how IL-10 does inhibit LPS-induced pro-inflammatory gene transcription, focusing the study on CXCL8 and TNF-a. Using quantitative chromatin immunoprecipitation (ChIP) analysis, we characterized the molecular events triggered by IL-10 at the level of CXCL8 and/or TNF-a gene promoters. Our data show that IL-10 triggers cell type specific mechanisms to inhibit LPS-induced CXCL8 and TNF-a transcription. In fact, IL-10 inhibits LPS-induced recruitment of Pol II to the CXCL8 and TNF-a promoter in neutrophils, but not in monocytes. Reduction of Pol II recruitment to the CXCL8 and TNF-a promoters in neutrophils correlates with a reduction of the levels of LPS-induced c-fos recruitment to the same promoters, thus suggesting a cause-effect relationship between these two events. Conversely, in monocytes, IL-10 reduces the recruitment of CDK9 induced by LPS and, as a consequence, inhibits LPS-induced activation (i.e. ser-2-phosphorylation) of promoter-bound Pol II. Inhibition of CDK9 recruitment by IL-10 proceeds in a gene specific manner. In fact, in the case of CXCL8, IL-10, via the recruitment and/or activation of an histone deacethylase, reduces the levels of acetylated histone H4. This results into the inhibition of Brd4 and, subsequently, of the Pol II activating Cyclin kinase 9 recruitment to the CXCL8 promoter. In the case of TNF-a, the decrease in promoter-bound CDK9 is likely to be dependent on IL-10-mediated reduction of LPS-induced association of c-Jun to the TNF-a promoter. Collectively, our data unravel novel and cell type-specific mechanisms utilized by IL-10 to inhibit LPS-induced CXCL8 and TNF-a transcription.