Neutrophils as social network cells

I neutrofili sono stati considerati per lungo tempo solo come cellule effettrici della risposta infiammatoria acuta, capaci esclusivamente di uccidere ed eliminare agenti patogeni infettivi. Tuttavia, dati più recenti hanno dimostrato che le funzioni di queste cellule sono molto più svariate di quanto si pensasse, in quanto si è capito che i neutrofili possiedono nel loro armamentario un repertorio di molecole effettrici che permettono loro di interagire con le altre cellule del sistema immunitario sia innato che specifico. Ciò ha permesso di stabilire che i neutrofili partecipano nei circuiti di comunicazioni che costituiscono le fondamenta dell’immunità, in tal maniera avendo la potenzialità di impartire istruzioni a quasi tutte le altre cellule immunitarie. Tuttavia, nonostante il numero di dimostrazioni sulla capacità dei neutrofili di interagire con vari tipi di cellule (come, per esempio monociti, macrofagi, cellule dendritiche, etc.) cresca di continuo, le nostre conoscenze riguardo questo nuovo aspetto della biologia dei neutrofili non sono ancora complete. Per questo motivo, come progetto di ricerca da svolgere durante la mia tesi di dottorato, mi sono occupata di identificare e caratterizzare interazioni, non ancora note, che i neutrofili sono in grado di stabilire con le cellule immunitarie. In particolare, il mio lavoro si è fondamentalmente sdoppiato su due linee di ricerca, ciascuna riferita ad uno specifico obiettivo, e precisamente: 1) Caratterizzare le interazioni tra neutrofili umani e linfociti T. 2) Caratterizzare le interazioni tra neutrofili umani e cellule “natural killer” (NK). 1) Il primo obiettivo del mio progetto di dottorato ha riguardato lo studio delle interazioni che i neutrofili umani stabiliscono con diverse classi di linfociti T, in particolare con i linfociti citotossici (CD8+) e i linfociti helper (CD4+) naive, oltre che con la sottopopolazione di linfociti T helper nota come Th17. I risultati che ho ottenuto dimostrano come i linfociti T CD4+ e, in modo più efficace, i linfociti T CD8+, entrambi attivati via CD3, favoriscano la sopravvivenza dei neutrofili e la loro espressione di marcatori di attivazione, quali CD11b, CD64 e CD62L. Tali effetti sono indipendenti dal contatto cellulare tra linfociti e neutrofili, mentre sono invece attribuibili alla produzione di fattori solubili da parte dei linfociti attivati, quali il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-a), l’interferone-gamma (IFN-g) e il fattore stimolante le colonie granulocitarie-macrofagiche (GM-CSF). Altri risultati hanno dimostrato come anche i linfociti Th17 attivati favoriscano la sopravvivenza e potenzino la funzionalità dei neutrofili. Anche in questo caso, gli effetti descritti dipendono da fattori solubili derivati dai Th17, quali GM-CSF, IFN-g e TNF-a, ma non, sorprendentemente, IL-17, come inizialmente si ritenesse. Un altro importante risultato emerso dai miei studi riguarda la capacità dei neutrofili e dei linfociti Th17, quando opportunamente attivati, di indurre gli uni il reclutamento degli altri tramite la produzione di chemochine specifiche. I risultati ottenuti in vitro sono poi stati anche avvalorati dalla dimostrazione dell’esistenza di una co-localizzazione di neutrofili e linfociti Th17 nel tessuto intestinale infiammato di pazienti affetti dal morbo di Crohn e nell’essudato sinoviale di pazienti con artrite reumatoide (RA). 2) Nella seconda parte della tesi ho invece descritto le interazioni che i neutrofili umani stabiliscono con le cellule NK. In particolare i dati che riporto mostrano come le cellule NK attivate siano in grado di favorire la sopravvivenza dei neutrofili, così come di aumentare la loro espressione di alcuni antigeni di membrana (come ad esempio CD64, CD11b e CD69). Un’analisi dettagliata dei meccanismi molecolari che regolano questi effetti ha permesso di definire che: a) la sopravvivenza dei neutrofili dipende dalla produzione di GM-CSF da parte delle cellule NK; b) l’espressione di CD64 sui neutrofili è interamente dipendente dall’IFN-g prodotto dalle cellule NK; c) l’aumento dell’espressione di CD11b e di CD69 sui neutrofili dipende sia dalla produzione di fattori solubili da parte delle cellule NK (quali IFN-g e GM-CSF), sia da un contatto cellulare tra i neutrofili e le cellule NK stesse quando co-coltivate insieme. Inoltre, la mia tesi riporta risultati che descrivono i meccanismi alla base di una complessa rete di interazioni che i neutrofili possono stabilire contemporaneamente con le cellule NK e con un sottotipo di cellule dendritiche mieloidi circolanti e tessutali recentemente descritto, note come cellule dendritiche 6-Sulfo LacNac+ (slanDC). In particolare ho dimostrato: da un lato, come i neutrofili potenzino la produzione di IL-12 da parte delle slanDC, cioè tramite interazioni cellula-cellula che coinvolgono le molecole di membrana CD18 sui neutrofili e ICAM-1 sulle slanDC; dall’altro lato, come i neutrofili stimolino direttamente le cellule NK a produrre IFN-g, cioè mediante interazioni cellula-cellula che coinvolgono le molecole di membrana CD18-CD11d delle NK e ICAM-3 dei neutrofili. L’IL-12 prodotta dalle slanDC, a sua volta, stimola le cellule NK a produrre IFN-g, il quale, di rimando, rinforza le interazioni che si creano tra i neutrofili e le slanDC. Ho infine validato tutte queste osservazioni fatte in vitro con una serie di risultati che provano una co-localizzazione di neutrofili, cellule NK e slanDC nei tessuti infiammati di pazienti con morbo di Crohn o con psoriasi. Complessivamente, i dati riportati in questa tesi di dottorato evidenziano la complessità delle interazioni che i neutrofili umani sono in grado di stabilire con altri tipi di leucociti, rimarcando ancora di più la capacità potenziale dei neutrofili nel regolare la risposta immunitaria innata e specifica, sia in condizioni fisiologiche che patologiche.

Neutrophils have long been viewed as the final effector cells of an acute inflammatory response only, exerting a primary role in the killing and clearance of extracellular pathogens. However, more recent observations have provided solid evidence that neutrophils can exert a wide variety of functions. For instance, the newly discovered repertoire of effector molecules that neutrophils possess in their armamentarium allows them to play a key role in the activation and regulation of innate and adaptive immune cells. Accordingly, it has been shown that neutrophils are part of the networks that form the foundations of immunity, in this manner dictating instructions to many immune cells. Although an increasing body of literature corroborates the neutrophil capacity to interact with immune cells (e.g., monocytes, macrophages, dendritic cells (DCs), etc.), our knowledge of cross-talks involving neutrophils remains not completely characterized. For such a reason, during my doctoral studies, I focused on how human neutrophils establish novel interactions with: different classes and subsets of T lymphocytes (TASK 1); natural killer cells (TASK 2). TASK 1. In the first part of my project, I have described the interactions that neutrophils engage with cytotoxic CD8+ T lymphocytes, CD4+ T helper (Th) lymphocytes and the Th17 subpopulation. In particular, I show how anti-CD3-activated CD4+ T cells and, more potently, anti-CD3-activated CD8+ T cells, positively modulate neutrophil survival and expression of activation markers, such as CD11b, CD64 and CD62L. The effects mediated by activated T cells occur independently from direct cellular interactions, as they are mainly attributable to their capacity to release tumor necrosis factor-alpha (TNF-a), interferon-gamma (IFN-g) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Moreover, I describe that Th17 cells favor the survival and functionality of neutrophils, effects that are, again, attributable to Th17-derived GM-CSF, IFN-g and TNF-a cytokines and not to interleukin-17 (IL-17), as initially presumed. A further important observation is that neutrophils and Th17 cells, once appropriately activated, secrete chemokines that induce their reciprocal recruitment. Consistent with the results obtained in vitro, neutrophils and Th17 cells were found to co-localize in gut tissue from Crohn’s disease and in the synovial fluid (SF) of rheumatoid arthritis (RA) patients. TASK 2. The second part of my thesis describes the reciprocal interactions that human neutrophils establish with NK cells. Indeed, I show how activated NK cells strongly protect the survival of neutrophils as well as potently up-regulate the expression of membrane molecules (CD64, CD11b and CD69). Analysis of the molecular events occurring in neutrophil/NK co-cultures has revealed that: a) neutrophil survival is positively affected by NK-derived GM-CSF; b) NK-derived IFN-g is almost entirely responsible for the induction of CD64; c) NK-derived IFN-g and GM-CSF, as well as direct neutrophil-NK cell-cell contact, up-regulate CD11b and CD69 in neutrophils. Finally, I also report the characterization of a complex network that neutrophil establish with both NK cells and a recently described subtype of circulating myeloid DC, namely the 6-Sulfo LacNac+ DCs (slanDCs). Specifically, I show that stimulated neutrophils directly interact with, and potentiate the activity of, both slanDCs and NK cells. As a result, neutrophils potentiate the production of IL-12p70 by slanDCs via a CD18/ICAM-1 interaction, which, in turn, stimulates activated NK cells to produce IFN-g. IFN-g further reinforces the interaction between neutrophils and slanDCs and the release of slanDC-derived IL-12p70, thus creating a positive feedback loop. On the other hand, neutrophils directly co-stimulate NK cells via CD18-CD11d/ICAM-3 interaction, leading to an increased production of IFN-g. All these in vitro data are also supported by additional results showing that neutrophils, NK cells, and slanDCs co-localize in inflamed tissues of both Crohn’s disease and psoriasis patients. In summary, the data collected in my thesis help to extend our knowledge on the complexity of all the possible neutrophil-leukocyte interactions that might regulate the immune response under physiological and/or pathological conditions.