Abstract La depressione è un disturbo psichiatrico che rappresenta oggi una delle principali cause di disabilità nel mondo; oltre all’impatto psichiatrico, responsabile fra l’altro di un alto tasso di suicidi, la depressione è associata a un’aumentata incidenza di malattie cardiovascolari e del diabete di tipo 2. Mentre è oggi possibile individuare i sintomi di tale disturbo con una certa sicurezza, le cause della depressione sono ancora sostanzialmente ignote. Se ne conoscono invece alcuni fattori di rischio, fra cui lo stress, disfunzioni endocrine e l’associazione tra predisposizione genetica, ambiente sociale e circostanze di vita. Lo sviluppo di modelli animali di depressione consente oggi lo studio dei correlati comportamentali e neurobiologici del disturbo, anche se nell’animale, naturalmente, non sono riproducibili ed analizzabili tutti i sintomi che caratterizzano la sindrome umana. La clomipramina, un noto farmaco antidepressivo triciclico, ha un effetto apparentemente paradossale se somministrata ripetutamente in ratti in età neonatale, inducendo nell’animale adulto sintomi comportamentali e neurobiologici riconducibili a una sindrome depressiva. Il meccanismo alla base di tale fenomeno è ancora ignoto, ma sono state avanzate ipotesi relative al ruolo dell’inibizione del sonno REM e all’alterazione della neurotrasmissione aminergica nel cervello ancora in fase di sviluppo. In questa tesi sono riportati i risultati di un’articolata indagine sui correlati neurobiologici e comportamentali del modello di somministrazione di clomipramina nel ratto neonato, attualmente non presenti o descritti in modo incompleto nella letteratura scientifica. In ciascuno degli esperimenti, gruppi di ratti Sprague-Dawley sono stati sottoposti, dal 5° al 21° giorno di vita postnatale, a trattamento con clomipramina (20 mg/kg i.p., due volte al giorno). Tali animali sono stati confrontati con ratti trattati con soluzione salina secondo il medesimo protocollo di somministrazione. Il comportamento degli animali trattati e di controllo è stato valutato tramite il forced swim test per l’attività locomotoria e il despair behavior, il sucrose preference test per la misura dell’anedonia e l’elevated plus maze test per l’attività di esplorazione spontanea e il tratto d’ansia. Gli animali trattati con clomipramina hanno mostrato in ciascuno dei test effettuati anomalie, seppur lievi in certi casi, compatibili con un quadro di depressione. Studi morfometrici basati sulla risonanza magnetica, eseguiti al fine di individuare cambiamenti volumetrici in aree cerebrali particolarmente coinvolte nei meccanismi della depressione, hanno rivelato negli animali trattati in età neonatale con clomipramina una diminuzione del volume totale del cervello ed un allargamento dei ventricoli laterali, ma nessuna alterazione significativa dell’ippocampo. Le indagini neurobiologiche condotte hanno messo in luce una serie di alterazioni, fra cui: 1) i livelli di brain-derived neurotrophic factor nell’ippocampo (ma non nella corteccia) degli animali trattati con clomipramina sono risultati inferiori rispetto ai controlli; 2) l’espressione del trasportatore della serotonina, analizzata in preparati istologici tramite densitometria ottica della marcatura immunoistochimica delle fibre e delle terminazioni serotonergiche, è diminuita nell’ippocampo e nella corteccia del cingolo degli animali trattati con clomipramina rispetto ai controlli; 3) la densità ottica della marcatura della glial fibrillary acidic protein, che caratterizza gli astrociti, è risultata modificata in correlazione con il sesso e l’età dell’animale. D’altra parte, il tasso di neurogenesi nell’ippocampo e la morfologia delle cellule granulari dell’ippocampo marcate con doublecortin, proteina associata con le fasi di migrazione e differenziamento ed espressa fino alle prime 3 settimane di vita della cellula, non sembrano aver risentito significativamente del trattamento con clomipramina effettuato in età neonatale. I dati suggeriscono nel complesso effetti dipendenti dal sesso, essendo le femmine tendenzialmente più sensibili al trattamento. È stata inoltre rilevata una riduzione degli effetti neurobiologici e comportamentali del trattamento con l’avanzare dell’età degli animali, con progressivo rientro nella norma nel confronto con animali di controllo di pari età. Il modello di somministrazione di clomipramina è stato ulteriormente caratterizzato studiando la reazione degli animali ad un evento acuto di stress. Il razionale dell’indagine risiedeva nell’osservazione che gli eventi di stress nella vita umana possono far emergere o esacerbare i sintomi di una sindrome depressiva; ipotizzando che ciò possa succedere anche per gli animali, si è deciso di analizzare a livello comportamentale le conseguenze di uno stress come quello da restraint, cioè la costrizione dell’animale all’immobilità all’interno di una trappola di rete metallica. In questa indagine, oltre agli animali trattati con salina o clomipramina in epoca neonatale, è stato introdotto un gruppo di animali non sottoposti a trattamento né a manipolazione da parte degli sperimentatori. Un’interazione tra trattamento in età neonatale e stress è stata individuata in più di una procedura sperimentale; in particolare, il gruppo di animali non manipolati ha mostrato differenze significative rispetto agli altri due gruppi di animali, suggerendo che la responsabilità dei sintomi osservati negli animali adulti potrebbe non essere limitata alle proprietà farmacologiche della clomipramina per se, ma potrebbe essere almeno parzialmente attribuita alla procedura nel suo insieme, incluse la manipolazione, il dolore per le iniezioni e la temporanea separazione dalla madre. Nel complesso, gli studi condotti forniscono importanti elementi di valutazione sull’efficacia e sull’appropriatezza del protocollo di somminstrazione neonatale di clomipramina come modello animale di depressione.

Abstract Depression is a widespread psychiatric disorder that represents a major cause of disability worldwide. Besides the significant mortality rate due to suicide, depression has been associated with an increased prevalence of coronary artery disease and type-2 diabetes. In spite of the accumulated knowledge on the heterogeneous collection of symptoms that characterize the disease, much has yet to be discovered about its pathophysiology. Risk factors include stressful life events, endocrine abnormalities, and genetic predispositions interacting with the environment. The development of animal models of depression have made it possible to study the behavioral and neurobiological correlates of the disease, although only a subset of the symptoms that characterize the human syndrome can be reproduced and studied in the animal. Clomipramine, a well-known tricyclic antidepressant, acts in an apparently paradoxical fashion when repeatedly administered to neonate rats. The treatment induces in the adult a series of behavioral and neurobiological effects similar to a depressive syndrome. The mechanisms underlying the phenomenon are still unknown, although hypotheses have been formulated on the potential depressogenic effects of clomipramine-dependent inhibition of REM sleep and alterations of the monoaminergic circuitry in a developing brain. In the present dissertation, I report the results of an in-depth investigation of the behavioral and neurobiological correlates of the neonatal clomipramine administration model of depression, not yet described or only partially analyzed in the literature. For each of the experiments, groups of Sprague-Dawley rats were subjected from the 5th to the 21st post-natal day to a protocol of clomipramine administration (20 mg/kg i.p., twice a day). The animals were compared with groups of rats treated with saline injections according to an identical schedule. Both groups of animals were tested for locomotor activity and despair behavior with the forced swim test, for anhedonic behavior with the sucrose preference test and for exploratory activity and anxiety trait with the elevated plus maze test. In all behavioral tests performed, clomipramine-treated animals showed abnormalities, although sometimes subtle, that can be attributed to depression-like symptoms, compared to saline-treated animals. Morphometric studies conducted by means of magnetic resonance imaging, performed to detect possible volumetric abnormalities in brain regions usually associated with depression, showed a significant decrease in brain volume in treated animals, together with a significant enlargement of the lateral ventricles, but no significant changes in the hippocampus. Investigations of the neurobiological correlates of the clomipramine treatment yielded results that include: 1) Brain-derived neurotrophic factor levels were significantly decreased in the hippocampus, but not in the cortex, of treated animals; 2) serotonin transporter expression, measured as optical density of the immunohistochemical labeling of the marker in brain sections, was decreased in the hippocampus and cingulate cortex of treated animals compared to the controls; 3) expression of the glial fibrillary acidic protein, a marker of astrocytes, was by neonatal treatment affected in relation with age and sex. On the other hand, hippocampal neurogenesis rate and hippocampal granule neuronal morphology were not significantly affected by treatment. The data suggest sex-dependent differences in the effects of clomipramine, with female rats being more responsive than males to the neonatal treatment. Furthermore, the behavioral symptoms as well as the neurobiological consequences of the treatment appeared to reduce with aging, to the point of almost complete recovery at an advanced age The neonatal clomipramine administration model was further characterized by testing the reaction of animals to an acute stressful event, in this case restraint stress realized by immobilizing animals with a wire mesh, on the rationale that such events can trigger or precipitate depression in humans and that a similar phenomenon may be observed in the animal model. For this study, a group of untreated rats, i.e. animals that were left undisturbed in their cages throughout their development, were added to the experimental design. An interaction between early life treatment and stress in adulthood was found in several experiments. Importantly, untreated animals showed substantial differences compared to the other two groups, suggesting that a significant fraction of the observed effects rather than being directly attributable to the pharmacological properties of clomipramine, may in fact depend on the procedure as a whole, including handling, injection discomfort, and separation from the mother. Overall, the studies reported here provide important elements for the evaluation of the efficacy and congruency of the early clomipramine treatment model of depression.

Behavioral, imaging, and neurochemical correlates of the neonatal clomipramine model of depression in the rat

TOGNOLI, Cristina
2012

Abstract

Abstract La depressione è un disturbo psichiatrico che rappresenta oggi una delle principali cause di disabilità nel mondo; oltre all’impatto psichiatrico, responsabile fra l’altro di un alto tasso di suicidi, la depressione è associata a un’aumentata incidenza di malattie cardiovascolari e del diabete di tipo 2. Mentre è oggi possibile individuare i sintomi di tale disturbo con una certa sicurezza, le cause della depressione sono ancora sostanzialmente ignote. Se ne conoscono invece alcuni fattori di rischio, fra cui lo stress, disfunzioni endocrine e l’associazione tra predisposizione genetica, ambiente sociale e circostanze di vita. Lo sviluppo di modelli animali di depressione consente oggi lo studio dei correlati comportamentali e neurobiologici del disturbo, anche se nell’animale, naturalmente, non sono riproducibili ed analizzabili tutti i sintomi che caratterizzano la sindrome umana. La clomipramina, un noto farmaco antidepressivo triciclico, ha un effetto apparentemente paradossale se somministrata ripetutamente in ratti in età neonatale, inducendo nell’animale adulto sintomi comportamentali e neurobiologici riconducibili a una sindrome depressiva. Il meccanismo alla base di tale fenomeno è ancora ignoto, ma sono state avanzate ipotesi relative al ruolo dell’inibizione del sonno REM e all’alterazione della neurotrasmissione aminergica nel cervello ancora in fase di sviluppo. In questa tesi sono riportati i risultati di un’articolata indagine sui correlati neurobiologici e comportamentali del modello di somministrazione di clomipramina nel ratto neonato, attualmente non presenti o descritti in modo incompleto nella letteratura scientifica. In ciascuno degli esperimenti, gruppi di ratti Sprague-Dawley sono stati sottoposti, dal 5° al 21° giorno di vita postnatale, a trattamento con clomipramina (20 mg/kg i.p., due volte al giorno). Tali animali sono stati confrontati con ratti trattati con soluzione salina secondo il medesimo protocollo di somministrazione. Il comportamento degli animali trattati e di controllo è stato valutato tramite il forced swim test per l’attività locomotoria e il despair behavior, il sucrose preference test per la misura dell’anedonia e l’elevated plus maze test per l’attività di esplorazione spontanea e il tratto d’ansia. Gli animali trattati con clomipramina hanno mostrato in ciascuno dei test effettuati anomalie, seppur lievi in certi casi, compatibili con un quadro di depressione. Studi morfometrici basati sulla risonanza magnetica, eseguiti al fine di individuare cambiamenti volumetrici in aree cerebrali particolarmente coinvolte nei meccanismi della depressione, hanno rivelato negli animali trattati in età neonatale con clomipramina una diminuzione del volume totale del cervello ed un allargamento dei ventricoli laterali, ma nessuna alterazione significativa dell’ippocampo. Le indagini neurobiologiche condotte hanno messo in luce una serie di alterazioni, fra cui: 1) i livelli di brain-derived neurotrophic factor nell’ippocampo (ma non nella corteccia) degli animali trattati con clomipramina sono risultati inferiori rispetto ai controlli; 2) l’espressione del trasportatore della serotonina, analizzata in preparati istologici tramite densitometria ottica della marcatura immunoistochimica delle fibre e delle terminazioni serotonergiche, è diminuita nell’ippocampo e nella corteccia del cingolo degli animali trattati con clomipramina rispetto ai controlli; 3) la densità ottica della marcatura della glial fibrillary acidic protein, che caratterizza gli astrociti, è risultata modificata in correlazione con il sesso e l’età dell’animale. D’altra parte, il tasso di neurogenesi nell’ippocampo e la morfologia delle cellule granulari dell’ippocampo marcate con doublecortin, proteina associata con le fasi di migrazione e differenziamento ed espressa fino alle prime 3 settimane di vita della cellula, non sembrano aver risentito significativamente del trattamento con clomipramina effettuato in età neonatale. I dati suggeriscono nel complesso effetti dipendenti dal sesso, essendo le femmine tendenzialmente più sensibili al trattamento. È stata inoltre rilevata una riduzione degli effetti neurobiologici e comportamentali del trattamento con l’avanzare dell’età degli animali, con progressivo rientro nella norma nel confronto con animali di controllo di pari età. Il modello di somministrazione di clomipramina è stato ulteriormente caratterizzato studiando la reazione degli animali ad un evento acuto di stress. Il razionale dell’indagine risiedeva nell’osservazione che gli eventi di stress nella vita umana possono far emergere o esacerbare i sintomi di una sindrome depressiva; ipotizzando che ciò possa succedere anche per gli animali, si è deciso di analizzare a livello comportamentale le conseguenze di uno stress come quello da restraint, cioè la costrizione dell’animale all’immobilità all’interno di una trappola di rete metallica. In questa indagine, oltre agli animali trattati con salina o clomipramina in epoca neonatale, è stato introdotto un gruppo di animali non sottoposti a trattamento né a manipolazione da parte degli sperimentatori. Un’interazione tra trattamento in età neonatale e stress è stata individuata in più di una procedura sperimentale; in particolare, il gruppo di animali non manipolati ha mostrato differenze significative rispetto agli altri due gruppi di animali, suggerendo che la responsabilità dei sintomi osservati negli animali adulti potrebbe non essere limitata alle proprietà farmacologiche della clomipramina per se, ma potrebbe essere almeno parzialmente attribuita alla procedura nel suo insieme, incluse la manipolazione, il dolore per le iniezioni e la temporanea separazione dalla madre. Nel complesso, gli studi condotti forniscono importanti elementi di valutazione sull’efficacia e sull’appropriatezza del protocollo di somminstrazione neonatale di clomipramina come modello animale di depressione.
depression; animal model; psychiatric disorders; Neurogenesis; stress; SERT
Abstract Depression is a widespread psychiatric disorder that represents a major cause of disability worldwide. Besides the significant mortality rate due to suicide, depression has been associated with an increased prevalence of coronary artery disease and type-2 diabetes. In spite of the accumulated knowledge on the heterogeneous collection of symptoms that characterize the disease, much has yet to be discovered about its pathophysiology. Risk factors include stressful life events, endocrine abnormalities, and genetic predispositions interacting with the environment. The development of animal models of depression have made it possible to study the behavioral and neurobiological correlates of the disease, although only a subset of the symptoms that characterize the human syndrome can be reproduced and studied in the animal. Clomipramine, a well-known tricyclic antidepressant, acts in an apparently paradoxical fashion when repeatedly administered to neonate rats. The treatment induces in the adult a series of behavioral and neurobiological effects similar to a depressive syndrome. The mechanisms underlying the phenomenon are still unknown, although hypotheses have been formulated on the potential depressogenic effects of clomipramine-dependent inhibition of REM sleep and alterations of the monoaminergic circuitry in a developing brain. In the present dissertation, I report the results of an in-depth investigation of the behavioral and neurobiological correlates of the neonatal clomipramine administration model of depression, not yet described or only partially analyzed in the literature. For each of the experiments, groups of Sprague-Dawley rats were subjected from the 5th to the 21st post-natal day to a protocol of clomipramine administration (20 mg/kg i.p., twice a day). The animals were compared with groups of rats treated with saline injections according to an identical schedule. Both groups of animals were tested for locomotor activity and despair behavior with the forced swim test, for anhedonic behavior with the sucrose preference test and for exploratory activity and anxiety trait with the elevated plus maze test. In all behavioral tests performed, clomipramine-treated animals showed abnormalities, although sometimes subtle, that can be attributed to depression-like symptoms, compared to saline-treated animals. Morphometric studies conducted by means of magnetic resonance imaging, performed to detect possible volumetric abnormalities in brain regions usually associated with depression, showed a significant decrease in brain volume in treated animals, together with a significant enlargement of the lateral ventricles, but no significant changes in the hippocampus. Investigations of the neurobiological correlates of the clomipramine treatment yielded results that include: 1) Brain-derived neurotrophic factor levels were significantly decreased in the hippocampus, but not in the cortex, of treated animals; 2) serotonin transporter expression, measured as optical density of the immunohistochemical labeling of the marker in brain sections, was decreased in the hippocampus and cingulate cortex of treated animals compared to the controls; 3) expression of the glial fibrillary acidic protein, a marker of astrocytes, was by neonatal treatment affected in relation with age and sex. On the other hand, hippocampal neurogenesis rate and hippocampal granule neuronal morphology were not significantly affected by treatment. The data suggest sex-dependent differences in the effects of clomipramine, with female rats being more responsive than males to the neonatal treatment. Furthermore, the behavioral symptoms as well as the neurobiological consequences of the treatment appeared to reduce with aging, to the point of almost complete recovery at an advanced age The neonatal clomipramine administration model was further characterized by testing the reaction of animals to an acute stressful event, in this case restraint stress realized by immobilizing animals with a wire mesh, on the rationale that such events can trigger or precipitate depression in humans and that a similar phenomenon may be observed in the animal model. For this study, a group of untreated rats, i.e. animals that were left undisturbed in their cages throughout their development, were added to the experimental design. An interaction between early life treatment and stress in adulthood was found in several experiments. Importantly, untreated animals showed substantial differences compared to the other two groups, suggesting that a significant fraction of the observed effects rather than being directly attributable to the pharmacological properties of clomipramine, may in fact depend on the procedure as a whole, including handling, injection discomfort, and separation from the mother. Overall, the studies reported here provide important elements for the evaluation of the efficacy and congruency of the early clomipramine treatment model of depression.
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