Biological impact of Quantum Dots in rodents

I Quantum Dots (QDs) sono nanoparticelle fluorescenti largamente impiegate nell’imaging in vivo, ex vivo ed in vitro, grazie alle loro straordinarie proprietà ottiche. In particolare, i QTracker® 800 (Invitrogen) sono una tipologia commerciale di QDs con emissione nel Near-Infra-Red (800nm), disegnati appositamente per l’esecuzione di studi in vivo di diagnosi nell’uomo o drug delivery in piccoli animali da laboratorio. Uno dei principali problemi relativi a queste nanoparticelle è la presenza di metalli pesanti, fondamentali per le proprietà ottiche, che, nel caso dei QTracker®, sono CdSeTe. Gli studi della possibile tossicità dei QDs che si trovano in letteratura sono stati effettuati principalmente in vitro e potrebbero non corrispondere in modo soddisfacente alla risposta scatenata in vivo dalle nanoparticelle. Lo scopo di questa tesi è quindi lo studio di biodistribuzione e potenziali effetti dannosi dei QDs in sistemi viventi, con particolare attenzione al sistema nervoso centrale, prima di poter utilizzare tali nanocomposti in campo clinico. In seguito al trattamento di topi Balb-c con QDs (con iniezione intravenosa di 10μl/g, 40pM) è stato eseguito uno studio di biodistribuzione, tramite visualizzazione in vivo con la tecnica di Optical Imaging, seguita dalla conferma con microscopia elettronica e microscopia confocale e quantificazione dei metalli pesanti mediante ICP-MS a 24h, 1, 2 e 3 settimane dopo l’iniezione. Si è constatato che i QDs sono in grado di penetrare attraverso i vasi nei tessuti animali e di accumularsi, in particolare, nel reticolo endoteliale di fegato e milza. Inoltre i QDs sono in grado di attraversare la barriera ematoencefalica e di accumularsi intorno ai vasi sanguigni e nel parenchima in diverse aree cerebrali, soprattutto nella corteccia. L’ICP-MS ha rivelato un accumulo di metalli pesanti nel cervello immediatamente dopo l’iniezione, e significativamente elevato per tutte le 3 settimane dello studio. Nel cervello, ad una settimana dal trattamento, si trovano aggregati di alcune decine di nanoparticelle, distribuiti in neuroni, cellule epiteliali e cellule della glia, sia nel citosol che nel nucleo, talora anche a livello di sinapsi, sulle guaine mieliniche che ricoprono gli assoni neuronali e nei mitocondri. Abbiamo quindi valutato se la presenza sporadica delle nanoparticelle possa causare anomalie comportamentali, ad esempio anomalie nell’attività locomotoria, nell’attività cognitiva ecc. Dati recenti indicano che tutte le cellule cerebrali dialogano fra loro, e che l'attività dei neuroni è profondamente influenzata dall'intera orchestra cellulare. L’ipotesi di base è che se i nanocomposti, presenti a livello del parenchima, innescano una risposta infiammatoria prolungata, questo può riverberarsi in una modificazione dell’eccitabilità del neurone e conseguentemente in una modificazione del comportamento dell’animale. La presenza di tali nanoparticelle a livello del sistema nervoso centrale ha indotto un’alterazione della memoria di riconoscimento a 3 settimane dopo il trattamento, valutata con il test del Novel Object Recognition (senza alterazioni delle capacità locomotorie). La presenza di tali nanoparticelle induce una risposta infiammatoria che rimane elevata per le 3 settimane, caratterizzata da un aumento di microglia e astrociti a livello della corteccia entorinale e dell’ippocampo (giro dentato, aree CA1, CA2, CA3), che corrispondono alle aree associate alla codifica dei processi mnesici. La Long Term Potentiation, un modello di plasticità sinaptica d’altra parte non ha evidenziato nessuna alterazione delle funzioni ippocampali ad 1 e 3 settimane dal trattamento. Abbiamo valutato poi se la presenza nel parenchima cerebrale di NPs possa portare ad alterazioni del ciclo sonno/veglia e dell’attività dell’animale nell’home cage. I dati ottenuti indicano che occorre una valutazione accurata degli effetti dei nanocomposti sulla salute umana, ed occorrono molti studi approfonditi sia in vitro che in vivo prima del loro utilizzo in biomedicina.

Quantum Dots (QDs) are fluorescent semiconductor nanocrystals that have a narrow and tunable emission wavelengths across the visible and infrared spectrum. This makes them a promising tool for in vivo, in vitro and ex vivo imaging (Smith et al., 2000). However, the assessment of biocompatibility and biosafety of QDs is a critical issue for further applications as diagnostic and imaging tools on humans. The work of this thesis focuses on non modified QTracker® 800 QDs, which are a commercial type of QDs with a heavy metals core of CdSeTe, specifically designed for in vivo vascular and tumour imaging, for their emission wavelength in the near infrared spectrum (800nm). The biodistribution of QTracker QDs is assessed in Balb-c mice (40pM, 10μl/g) during 3 weeks following an i.v. injection. Accumulation is monitored using inductively coupled plasma mass spectroscopy, optical imaging, confocal microscopy and electron microscopy, and revealed a major accumulation of QDs in liver and spleen, specifically in the mononuclear phagocytic system. The accumulation in the brain is observed over 3 weeks, suggesting a long biological half-life, in the scale of weeks or months. It is in particularly observed around blood vessels, in different brain areas. QDs are found in neurons, glia and epithelial cells, both in cytosol and nucleus. Animal’s behaviour is investigated and novel object recognition test shows that QDs can significantly impair recognition memory at 3 weeks after treatment (with no locomotory and coordination alterations observed). Such impairment is possibly due to the alteration of physiological conditions in the anatomical regions that encode for recognition memory, such as enthorinal and perirhinal cortices, dentate gyrus and areas CA1-CA3 of hippocampus. Therefore, an increased inflammatory response in terms of microglia and astrocytes activation is observed in all these regions. However, it do not have an effect on hippocampal plasticity, which is investigated by measuring long term potentiation (LTP) at 1 and 3 weeks after treatment. Taken together, the data presented in this thesis suggest that due to long term accumulation, induction of neuroinflammation and behavioural changes, the application of QDs in human should be cautious.