Epithelial cells undergoing Epithelial Mesenchymal Transition in Systemic Sclerosis lack caveolin-1 and modulate WNT signaling in the dermis by secreting SFRP4

La Graft Versus Host Disease cronica (cGVHD) con interessamento cutaneo si presenta nel 5-15% dei casi con un fenotipo fibrotico. Questa variante è definita sclerotic-cGVHD ed è stato suggerito essere un modello utile per studiare l’immunopatogenesi della sclerodermia. In primis abbiamo analizzato gli aspetti istopatologici della GVHD cronica e della sclerotic-GVHD concentrandoci sulla quantificazione della matrice extracellulare e sul diametro dei vasi da una parte e sugli aspetti molecolari-immunologici peculiari della sclerodermia dall’altra, come la riduzione di espressione di caveolina-1. Inoltre, ci siamo proposti di identificare i geni che possono legare l’attivazione del sistema immunitario con la risposta fibrotica nella sclerodermia attraverso l’analisi comparativa del trascriptoma delle biopsie cutanee ricavate dai pazienti affetti da sclerodermia, GVHD cronica fibrotica e non fibrotica. Abbiamo arruolato 13 pazienti affetti da GVHD cronica, 93 pazienti sclerodermici e 3 volontari sani. Le biopsie cutanee unitamente ai dati clinici e ai campioni di siero sono state effettuate su 5 pazienti affetti da GVHD cronica non fibrotica, 9 pazienti con fenotipo fibrotico, 8 pazienti affetti da sclerodermia e 3 soggetti sani; I dati clinici e un campione di siero è stato invece raccolto da 80 pazienti sclerodermici seguiti presso il DH della Reumatologia dell’Azienda Ospedaliera Integrata di Verona. Le biopsie cutanee sono state divise in due parti: una parte è stata conservata in RNA later fino all’utilizzo, l’altra fissata in paraformaldeide per I preparati istologici. Abbiamo poi scelto di analizzare l’espressione genica sulla cute affetta dei pazienti con GVHD cronica di 84 geni derivanti dalla metanalisi dei lavori di microarray effettuati sulla cute sclerodermica su un totale di 36 pazienti. La PCR real time è stata utilizzata per studiare l’espressione di questi geni che abbiamo chiamato “scleroderma signature” nelle biopsie cutanee dei pazienti con il fenotipo fibrotico e non fibrotico di GVHD cronica. I risultati sono stati quindi validati mediante esperimenti di Immunofluorescenza sulle biopsie cutanee e con seguente analisi con microscopio confocale. I livelli di proteine circolati prodotto dei geni testate sono state misurate nel siero con test ELISA. Per la validazione funzionale abbiamo eseguito studi in vitro sulle cellule epiteliali. La correlazione dei livelli proteici risultati dagli ELISA e i parametri clinici è stata analizzata utilizzando il software SPSS 18. Abbiamo dimostrato come sulle cuti affette da Scl-GVHD vi fosse un incremento di spessore dovuto al deposito di matrice extracellulare del tutto simile alla sclerodermia, mentre nella Scl- GVHD non si osservava la riduzione del lume dei vasi epidermici. Inoltre l’espressione di caveolina-1 è risultata notevolmente diminuita nella GVHD cronica con fenotipo fibrotico rispetto ai soggetti sani e alla GVHD cronica senza fibrosi, tale riduzione era stata osservata in maniera simile nella sclerodermia. La RT-PCR dei 86 geni tipicamente disregolati nella sclerodermia ha dimostrato che solo 4 geni presentano un’espressione specifica e concordante nella sclerodermia e nella scl-GVHD; tra questi Secreted Frizzled Receptor 4. Esperimenti di doppia immunofluorescenza, seguiti da analisi con microscopia confocale sulle biopsie cutanee dei pazienti affetti da scl-GVHD e sclerodermia hanno evidenziato come fonte di aumentata espressione di SFRP4 i fibroblasti, le cellule epiteliali dello strato basale e germinale dell’epidermide e i melanociti. Le cellule esprimenti SFRP4 nello strato basale dell’epidermide risultavano positive alla vimentina e negative alla caveolina. Dagli studi in vitro è stato poi dimostrato che le cellule epiteliali indotte in transizione mesenchimale grazie alla stimolazione con TGF- beta riducevano l’espressione di caveolina 35%, aumentavano l’espressione di SFRP4 del 52% come mRNA e del 68% come proteina. Inoltre I livelli sierici di SFRP4 correlavano inversamente con la Diffusion lung capacity (r=0.234 p=0.001) e correlavano direttamente con il Rodnann skin score (mRSS) nei pazienti con funzione polmonare normale.

Chronic Graft Versus Host Disease (cGVHD) can present in 5-15% of cases with fibrotic skin involvement. This variant is defined as sclerotic-cGVHD and it has been suggested as a useful model to study the immunopathogenesis of systemic sclerosis (SSc) fibrosis. We analysed the histopathological features of cGVHD and scl-GVHD focusing on amount of extracellular matrix and vessel lumen ratio as well as immunohistochemical features peculiar of SSc like decreased expression of the lipid raft protein caveolin-1. Additionally, we aimed to identify the genes that may bridge the immune activation and the fibrotic response in SSc by comparative analysis of the transcriptome of skin biopsies from SSc, cGVHD and scl-GVHD. Thirteen patients with diagnosis of cGVHD, 93 with SSc and 3 healthy volunteers were enrolled in the University Hospital of Verona, Italy. Skin biopsies, serum samples and clinical data were collected for 5 Patients with cGVHD, 9 with scl-GVHD, 8 with SSc and 3 from healthy controls, only sera and clinical data were collected from 80 SSc patients. Biopsies were split in two halves, one stored in RNA later and the other one fixed in parafolmadehide for paraffin embedding. We selected 84 genes as intrinsic scleroderma signature from a metanalysis of microarray data from skin biopsies of 36 SSc patients. Real time PCR of all the genes was performed in cGVHD and scl-GVHD skin biopsies. Results were validated by Immunofluorescence followed by confocal laser scanning microscopy on skin biopsies and ELISA on serum. In vitro studies on epithelial cells were performed for functional validation. Correlation of the ELISA results and clinical parameters was performed using SPSS 18 software. Scl-GVHD skin biopsies showed a thickened dermis with increased ECM and reduction of total vessel lumen similar to SSc, whereas cGVHD did not. Moreover the expression of caveolin-1 was markedly decreased in scl-GVHD compared to healthy skin or cGVHD, similarly to SSc. RT-PCR of the 86 genes of the intrinsic SSc signature showed that only 4 genes had a specific and concordant pattern of expression in scl-GVHD and SSc, among these Secreted Frizzled Receptor 4. Double-immunofluorescence followed by confocal laser scanning microscopy of scl-GVHD and SSc skin biopsies showed that the source of increased expression of SFRP4 were dermal fibroblasts, epithelial cells in the germinal layer of the epidermis and Melanocytes. Further characterization of SFRP4 positive cells in the germinal layer indicated that these cells were vimentin positive and caveolin-1 negative. In vitro studies on epithelial cells indicated that TGF-β induced epithelial to Mesenchymal transition was indeed associated with decrease by 35% in caveolin-1 expression and increase of SFRP4 expression of 52% at mRNA level and 68% at protein level. Additionally, The serum levels of SFRP4 correlated inversely with Diffusion lung capacity (r=0.234 p=0.001) and positively with mRSS in patients with normal lung function.