La linea generale su cui si sviluppa il mio progetto di dottorato è la ricerca e misurazione quantitativa di biomarcatori, ed è inserito nel più ampio campo della diagnostica medica. Un biomarcatore è definito in modo chiaro dalla Food and Drug Administration statunitense come “una caratteristica che sia oggettivamente misurabile e valutabile come indicatore di processi fisiologici o patologici o di risposta a trattamento con farmaci”. Il primo progetto di ricerca di questo periodo di dottorato consiste in un’analisi proteomica differenziale su siero di cordone ombelicale e fluido amniotico alla ricerca di biomarcatori di ritardo di crescita intrauterino, una patologia altrimenti detta IUGR (Intra Uterine Growth Restriction). Nel progetto in questione sono stati analizzati campioni di siero di cordone ombelicale e fluido amniotico provenienti da madri al termine della gravidanza, per le quali sia stato diagnosticato (si parla di “casi”) o meno (“controlli”) un ritardo di crescita intrauterino. Con la tecnica della elettroforesi bidimensionale su gel di poliacrilammide (2D-PAGE) la moltitudine di proteine presenti nei suddetti campioni è stata dipanata, in modo da identificare separatamente le singole proteine sovra- o sottoespresse in caso di patologia. Il risultato è stato l’identificazione di 14 proteine uniche nel siero e 11 nel cordone ombelicale, concorrenti complessivamente a determinare un quadro d’insieme della patologia. Queste proteine sono coinvolte in processi alterati nel caso di ritardo di crescita intrauterino, in particolare: coagulazione del sangue, pressione sanguigna, difese immunitarie, omeostasi di ferro e rame, stress ossidativo. I risultati forniti dall’elettroforesi bidimensionale sono stati validati in modo incrociato con Western Blot, applicato su 5 proteine scelte per importanza fisiologica o livello di sovra- o sottoespressione. Di particolare spicco nel determinare il quadro complessivo di modulazione proteica sono state: transferrina (coinvolta nel trasporto di ossigeno nel sangue), kininogeno (coinvolta nei processi di coagulazione e di modulazione della pressione sanguigna), fibrinogeno (coinvolta nel processo di coagulazione del sangue), angiotensinogeno (uno dei soggetti implicati nella regolazione della pressione sanguigna) e componente C3 del complemento (complesso proteico implicato nella cosiddetta “immunità innata”). Diverse condizioni patologiche sono innescate da un’ alterazione di un meccanismo fisiologico in particolare: la comunicazione attraverso la fosforilazione delle proteine, facente parte del gruppo delle cosiddette modificazioni post-traslazionali (PTM, Post Translational Modifications). Queste sono modificazioni chimiche delle proteine nella fase successiva alla loro sintesi ribosomiale, che a valle di una serie di passaggi trasforma in una molecola effettiva l’informazione potenziale contenuta nel DNA. Alterazioni in questo processo biologico sono causa di gravi malattie come cancro, neurodegenerazione e diabete e gli studi degli scienziati hanno fatto emergere la necessità di nuovi materiali per la cattura delle fosfoproteine, soggetti rari in un mare di proteine non fosforilate. Allo scopo una tecnologia promettente è lo stampo molecolare di polimeri (Molecular Imprinting of Polymers, MIP), che sfrutta la molecola oggetto di analisi per formare attorno a sé una tasca complementare ad essa, in grado di riconoscerla e legarla successivamente quando rimossa dalla matrice stessa. Data poi la dimensione nanometrica delle proteine, lavorare sulla stessa scala dimensionale favorisce l’efficacia del riconoscimento delle molecole, come avviene per l’interazione antigene-anticorpo. L’idea che nasce da questa premessa è quindi quella della sintesi e caratterizzazione di nanoparticelle stampate molecolarmente per il riconoscimento di fosfoproteine e fosfopeptidi: il secondo progetto seguito durante questo periodo di dottorato di ricerca. La fase sperimentale ha portato a sintetizzare e caratterizzare fisicamente nanoparticelle (cioè particelle aventi almeno una dimensione al di sotto dei 100 nanometri) di copolimeri con 4 ricette diverse, in presenza o meno del templato: fosfotirosina protetta all’azoto terminale con fluorenilmetossicarbonile (Fmoc). La fase di verifica delle proprietà di legame è stata effettuata su una ricetta delle quattro, preparata stavolta con metodo standardizzato, ovvero non sotto forma di nanoparticelle. Si è valutata la capacità di legare fosfotirosina in sue soluzioni a concentrazione crescente. I risultati vedono una tendenza di legame a saturazione nel polimero stampato, mentre un accumulo crescente di substrato nel caso del polimero non stampato. La capacità di legame del MIP è attorno ai 3μg fosfotirosina/mg polimero. Ma l’individuazione dei marcatori di patologie è solo una fase del processo della diagnosi medica: una volta individuato un marcatore di patologia è necessario mettere a punto un metodo di misura dello stesso. Questo metodo dovrà essere il più possibile sensibile alle concentrazioni dell’analita nel campione in esame e specifico per esso, in modo da non confondere un segnale derivante da un fondo di molecole con la sua presenza. Un grosso beneficio alla condizione del paziente può anche derivare dalla possibilità di misurare l’analita nel luogo dove si trova la persona, attuando così quella che si chiama “point of care diagnostics”. A tale scopo esistono delle tecniche analitiche che più si prestano alla realizzazione di dispositivi portatili semplici: una di queste è la risonanza plasmonica superficiale (Surface Plasmon Resonance, SPR). La terza parte del mio periodo di dottorato è stata quindi dedicata alla messa a punto di un metodo di rilevazione di un ormone peptidico, l’epcidina, sfruttando la suddetta tecnica. L’analita in questione è il principale regolatore del metabolismo del ferro, e la realizzazione di una metodica analitica sensibile ed efficace per la sua misurazione è considerata essere effettivamente necessaria dalla comunità scientifica internazionale. I risultati ottenuti in questa parte sperimentale sono stati la creazione di una curva di calibrazione per l’epcidina in concentrazioni nel range pato-fisiologico 1-100ng/mL, una verifica della scarsa interazione del nostro sistema di cattura dell’epcidina nei confronti di un suo competitore, una sua forma troncata, più la valutazione della costante di affinità dell’analita per il legante utilizzato nella cattura, risultata essere 50nM, quindi in linea con precedenti misurazioni in soluzione.

Medical diagnosis is the process of attempting to determine and/or identify a possible disease or disorder. This process is revealed by biomarkers, defined by The Food and Drug Administration (FDA) as “characteristics that are objectively measured and evaluated as indicators of normal biologic processes, pathogenic processes, or pharmacologic responses to a therapeutic intervention”. The process of biomarker discovery has been boosted in the last years by proteomics, a research discipline that takes a snapshot of the entire wealth of proteins in an organism/ tissue/ cell/ body fluid. An implementation of the analysis methods can help in isolate proteins present in the low range of concentrations, like biomarkers very often are. An established biomarker can further be measured with the help of biosensors, devices that can be employed in the point-of care diagnostics. This PhD thesis shows and discusses the results of three projects in the field of protein biomarkers discovery and quantification. The first project exploited proteomics techniques to find relevant protein markers for Intrauterine Growth Restriction (IUGR) in cordonal blood serum (UCS) and amniotic fluid (AF). A 14 proteins in UCS and 11 in AF were successfully identified and found to be differentially expressed. Molecularly Imprinted Polymers (MIPs) directed towards proteins and peptides containing phosphotyrosine were then produced, with the final goal of selectively extract phosphopeptides from a peptide mixture. An alteration of the phosphorylation pattern is often associated to important diseases like cancer. The polymers were produced as nanoparticles, that were characterized with Dynamic Light Scattering (DLS) and Atomic Force Microscopy (AFM). A recipe was also tested for binding capacity towards phosphotyrosine. A Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensor to quantify hepcidin hormone was finally produced. This is the major subject in iron homeostasis in vertebrates and marker of iron unbalance diseases. A calibration curve was made and affinity/kinetic parameters for the ligand employed were measured.

Discovery and quantification of proteins of biological relevance through differential proteomics and biosensing

LONARDONI, Francesco
2012

Abstract

La linea generale su cui si sviluppa il mio progetto di dottorato è la ricerca e misurazione quantitativa di biomarcatori, ed è inserito nel più ampio campo della diagnostica medica. Un biomarcatore è definito in modo chiaro dalla Food and Drug Administration statunitense come “una caratteristica che sia oggettivamente misurabile e valutabile come indicatore di processi fisiologici o patologici o di risposta a trattamento con farmaci”. Il primo progetto di ricerca di questo periodo di dottorato consiste in un’analisi proteomica differenziale su siero di cordone ombelicale e fluido amniotico alla ricerca di biomarcatori di ritardo di crescita intrauterino, una patologia altrimenti detta IUGR (Intra Uterine Growth Restriction). Nel progetto in questione sono stati analizzati campioni di siero di cordone ombelicale e fluido amniotico provenienti da madri al termine della gravidanza, per le quali sia stato diagnosticato (si parla di “casi”) o meno (“controlli”) un ritardo di crescita intrauterino. Con la tecnica della elettroforesi bidimensionale su gel di poliacrilammide (2D-PAGE) la moltitudine di proteine presenti nei suddetti campioni è stata dipanata, in modo da identificare separatamente le singole proteine sovra- o sottoespresse in caso di patologia. Il risultato è stato l’identificazione di 14 proteine uniche nel siero e 11 nel cordone ombelicale, concorrenti complessivamente a determinare un quadro d’insieme della patologia. Queste proteine sono coinvolte in processi alterati nel caso di ritardo di crescita intrauterino, in particolare: coagulazione del sangue, pressione sanguigna, difese immunitarie, omeostasi di ferro e rame, stress ossidativo. I risultati forniti dall’elettroforesi bidimensionale sono stati validati in modo incrociato con Western Blot, applicato su 5 proteine scelte per importanza fisiologica o livello di sovra- o sottoespressione. Di particolare spicco nel determinare il quadro complessivo di modulazione proteica sono state: transferrina (coinvolta nel trasporto di ossigeno nel sangue), kininogeno (coinvolta nei processi di coagulazione e di modulazione della pressione sanguigna), fibrinogeno (coinvolta nel processo di coagulazione del sangue), angiotensinogeno (uno dei soggetti implicati nella regolazione della pressione sanguigna) e componente C3 del complemento (complesso proteico implicato nella cosiddetta “immunità innata”). Diverse condizioni patologiche sono innescate da un’ alterazione di un meccanismo fisiologico in particolare: la comunicazione attraverso la fosforilazione delle proteine, facente parte del gruppo delle cosiddette modificazioni post-traslazionali (PTM, Post Translational Modifications). Queste sono modificazioni chimiche delle proteine nella fase successiva alla loro sintesi ribosomiale, che a valle di una serie di passaggi trasforma in una molecola effettiva l’informazione potenziale contenuta nel DNA. Alterazioni in questo processo biologico sono causa di gravi malattie come cancro, neurodegenerazione e diabete e gli studi degli scienziati hanno fatto emergere la necessità di nuovi materiali per la cattura delle fosfoproteine, soggetti rari in un mare di proteine non fosforilate. Allo scopo una tecnologia promettente è lo stampo molecolare di polimeri (Molecular Imprinting of Polymers, MIP), che sfrutta la molecola oggetto di analisi per formare attorno a sé una tasca complementare ad essa, in grado di riconoscerla e legarla successivamente quando rimossa dalla matrice stessa. Data poi la dimensione nanometrica delle proteine, lavorare sulla stessa scala dimensionale favorisce l’efficacia del riconoscimento delle molecole, come avviene per l’interazione antigene-anticorpo. L’idea che nasce da questa premessa è quindi quella della sintesi e caratterizzazione di nanoparticelle stampate molecolarmente per il riconoscimento di fosfoproteine e fosfopeptidi: il secondo progetto seguito durante questo periodo di dottorato di ricerca. La fase sperimentale ha portato a sintetizzare e caratterizzare fisicamente nanoparticelle (cioè particelle aventi almeno una dimensione al di sotto dei 100 nanometri) di copolimeri con 4 ricette diverse, in presenza o meno del templato: fosfotirosina protetta all’azoto terminale con fluorenilmetossicarbonile (Fmoc). La fase di verifica delle proprietà di legame è stata effettuata su una ricetta delle quattro, preparata stavolta con metodo standardizzato, ovvero non sotto forma di nanoparticelle. Si è valutata la capacità di legare fosfotirosina in sue soluzioni a concentrazione crescente. I risultati vedono una tendenza di legame a saturazione nel polimero stampato, mentre un accumulo crescente di substrato nel caso del polimero non stampato. La capacità di legame del MIP è attorno ai 3μg fosfotirosina/mg polimero. Ma l’individuazione dei marcatori di patologie è solo una fase del processo della diagnosi medica: una volta individuato un marcatore di patologia è necessario mettere a punto un metodo di misura dello stesso. Questo metodo dovrà essere il più possibile sensibile alle concentrazioni dell’analita nel campione in esame e specifico per esso, in modo da non confondere un segnale derivante da un fondo di molecole con la sua presenza. Un grosso beneficio alla condizione del paziente può anche derivare dalla possibilità di misurare l’analita nel luogo dove si trova la persona, attuando così quella che si chiama “point of care diagnostics”. A tale scopo esistono delle tecniche analitiche che più si prestano alla realizzazione di dispositivi portatili semplici: una di queste è la risonanza plasmonica superficiale (Surface Plasmon Resonance, SPR). La terza parte del mio periodo di dottorato è stata quindi dedicata alla messa a punto di un metodo di rilevazione di un ormone peptidico, l’epcidina, sfruttando la suddetta tecnica. L’analita in questione è il principale regolatore del metabolismo del ferro, e la realizzazione di una metodica analitica sensibile ed efficace per la sua misurazione è considerata essere effettivamente necessaria dalla comunità scientifica internazionale. I risultati ottenuti in questa parte sperimentale sono stati la creazione di una curva di calibrazione per l’epcidina in concentrazioni nel range pato-fisiologico 1-100ng/mL, una verifica della scarsa interazione del nostro sistema di cattura dell’epcidina nei confronti di un suo competitore, una sua forma troncata, più la valutazione della costante di affinità dell’analita per il legante utilizzato nella cattura, risultata essere 50nM, quindi in linea con precedenti misurazioni in soluzione.
IUGR; 2D-PAGE; phosphoproteomics; MIPs; nanoparticles; hepcidin; biosensors
Medical diagnosis is the process of attempting to determine and/or identify a possible disease or disorder. This process is revealed by biomarkers, defined by The Food and Drug Administration (FDA) as “characteristics that are objectively measured and evaluated as indicators of normal biologic processes, pathogenic processes, or pharmacologic responses to a therapeutic intervention”. The process of biomarker discovery has been boosted in the last years by proteomics, a research discipline that takes a snapshot of the entire wealth of proteins in an organism/ tissue/ cell/ body fluid. An implementation of the analysis methods can help in isolate proteins present in the low range of concentrations, like biomarkers very often are. An established biomarker can further be measured with the help of biosensors, devices that can be employed in the point-of care diagnostics. This PhD thesis shows and discusses the results of three projects in the field of protein biomarkers discovery and quantification. The first project exploited proteomics techniques to find relevant protein markers for Intrauterine Growth Restriction (IUGR) in cordonal blood serum (UCS) and amniotic fluid (AF). A 14 proteins in UCS and 11 in AF were successfully identified and found to be differentially expressed. Molecularly Imprinted Polymers (MIPs) directed towards proteins and peptides containing phosphotyrosine were then produced, with the final goal of selectively extract phosphopeptides from a peptide mixture. An alteration of the phosphorylation pattern is often associated to important diseases like cancer. The polymers were produced as nanoparticles, that were characterized with Dynamic Light Scattering (DLS) and Atomic Force Microscopy (AFM). A recipe was also tested for binding capacity towards phosphotyrosine. A Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensor to quantify hepcidin hormone was finally produced. This is the major subject in iron homeostasis in vertebrates and marker of iron unbalance diseases. A calibration curve was made and affinity/kinetic parameters for the ligand employed were measured.
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Tipologia: Tesi di dottorato
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