Integrated analysis of novel signal transduction pathways in red cells from patients with neuroacanthocytosis

Il termine neuroacantocitosi (NA) raggruppa diverse malattie genetiche rare che condividono manifestazioni neurologiche simili e la presenza di globuli rossi stellati nella circolazione periferica, gli acantociti. Le due principali malattie classificate come NA sono Corea acantocitosi (ChAc) e sindrome di McLeod (MLS). Poiché la presenza di acantociti è una caratteristica comune di questi disordini, lo studio dei meccanismi alla base della loro formazione può aiutare a comprendere la patogenesi delle NA. In questa tesi viene presentata una serie di studi sui meccanismi di signaling e sulle modificazioni strutturali di globuli rossi di pazienti di ChAc e MLS. Nel primo studio abbiamo analizzato con tecniche di proteomica la fosforilazione in tirosina di globuli rossi di pazienti affetti da ChAc . Nei globuli rossi di questi pazienti abbiamo riscontrato un aumento della fosforilazione in tirosina su diverse proteine di membrana e legate alla membrana tra cui banda 3, β-spectrina e adducina. In particolare, la fosforilazione sul residuo Tyr-904 della banda 3, target della chinasi Lyn, era molto elevata, mentre sul residuo Tyr-8 della stessa proteina, target della chinasi Syk, non abbiamo riscontrato un aumento della fosforilazione. Nei pazienti di ChAc, la fosforilazione della banda 3 da parte di Lyn è indipendente dal meccanismo canonico di fosforilazione sequenziale mediato da Syk. Le alterazioni dell’organizzazione delle proteine di membrana correlate con ChAc sembrano quindi essere il risultato di un aumento della fosforilazione in tirosina che porta a cambiamenti nel legame della banda 3 con i ponti multiproteici tra la membrana e il citoscheletro. Proponiamo quindi quest’alterazione nell’associazione tra membrana e citoscheletro mediata da fosforilazione in tirosina come un nuovo meccanismo che porta alla formazione di acantociti in ChAc. Nel secondo studio abbiamo combinato i nostri set di dati fosfo-proteomici su eritrociti di pazienti di ChAc e MLS con l’analisi topologica di network proteici per predirre quali sub-network della trasduzione del segnale possano essere coinvolti nella formazione degli acantociti. Abbiamo identificato tutte le interazioni che legano le due proteine mutate nelle due patologie in esame (rispettivamente coreina e XK) con le proteine differenzialmente fosforilate dei nostri dati sperimentali. Quindi, abbiamo analizzato nello specifico solo cluster di proteine coinvolte nella trasduzione del segnale che interagiscono molto strettamente tra loro e che possono essere coinvolte nella formazione di acantociti in entrambe le patologie. Abbiamo identificato un cluster di 14 chinasi che possono essere coinvolte in tale processo e meritano ulteriori approfondimenti. Come studio preliminare nel contesto di una collaborazione internazionale abbiamo analizzato globuli rossi da pazienti affetti da Neurodegenerazione con Accumulo di Ferro nel Cervello (NBIA) e di loro parenti di primo grado. Il nostro scopo era quello di determinare se fossero presenti acantociti nei pazienti e nei soggetti correlati ma privi di sintomi clinici e di studiare le caratteristi che strutturali dei loro eritrociti. Nell’ultimo studio abbiamo validato con l’applicazione a tecniche di analisi proteomica un nuovo copolimero basato su acrilamide e polivinil alcool modificato con gruppi olefinici. Questo nuovo idrogel è semplice da maneggiare anche a basse concentrazioni e la sua macroporosità lo rende particolarmente adatto alla separazione di proteine ad alto peso molecolare quale la coreina.

Neuroacanthocytosis (NA) is a group of rare genetic disorders that share similar neurological clinical manifestations and the presence of thorny red cells in the peripheral circulation, the acanthocytes. The two core NA diseases are Chorea-Acanthocytosis (ChAc) and McLeod Syndrome (MLS). Since acanthocytes are an hallmark of NA, studying the mechanisms underlying the generation of acanthocytes might shed light on the pathogenesis of NA syndromes. Here, we present a set of studies on the signaling mechanisms and structural changes in red cells from ChAc and MLS patients. In the first study, we evaluated tyrosine phosphorylation of red cells from ChAc patients by proteomics analysis. Increased Tyr-phosphorylation state of several membrane proteins including band 3, β-spectrin and adducin was found in ChAc RBCs. In particular, band 3 was highly phosphorylated on the Tyr-904 residue, a functional target of Lyn, but not on Tyr-8, a functional target of Syk. In ChAc RBCs band 3 Tyr-phosphorylation by Lyn was independent of the canonical Syk mediated pathway. The ChAc-associated alterations in RBC membrane-protein organization appear to be the result of increased Tyr-phosphorylation leading to altered linkage of band 3 to the junctional complexes involved in anchoring the membrane to the cytoskeleton. We propose this altered association between cytoskeleton and membrane proteins as a novel mechanism in the generation of acanthocytes in ChAc. In the second study, we combined phosphoproteomics datasets on ChAc and MLS with network topology analysis to predict signaling sub-networks involved in acanthocyte generation. We identified all the interactomic shortest paths linking the two proteins mutated in NA syndromes, respectively chorein and XK, to the differentially phosphorylated proteins in our proteomics data. Then, we refined the analysis considering only restricted clusters of highly interacting signaling proteins which can be involved in acanthocyte formation in both diseases. We identified a cluster of 14 kinases that might be related to red cell shape alterations and deserve further investigation. As preliminary study in the context of an international collaboration we analyzed red cells from Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation (NBIA) patients and their first degree relatives. Our aim was to assess the presence of acanthocytes in these subjects and to study their structural characteristics. In the last study, we validated a new co-polymer based on acrylamide and polyvinyl alcohol bearing olefinic moieties in proteomic analysis of red cells. This new hydrogel is easy to handle and its macroporosity makes it suitable for the separation of high molecular weight proteins such as chorein.