Role of HTLV Tax proteins post-Translational modifications in the induction of signaling pathways

I retrovirus HTLV-1 e HTLV-2, nonostante condividano una struttura genetica molto simile, mostrano significative differenze in patogenicità. In particolare, HTLV-1 è correlato ad una forma particolarmente aggressiva di leucemia, chiamata Leucemia delle cellule T dell’adulto (ATL, Adult T-cell Leukemia). È, inoltre, l’agente causale della mielopatia associata ad HTLV Paraparesi Spastica Tropicale (HAM/TSP, HTLV associated myelophaty/Tropical Spastic Paraperesis), una forma progressiva ed inabilitante di demielinizzazione neuronale. Diversamente, HTLV-2 non è associato a disordini linfoproliferativi, malgrado sia correlato a sindromi neuronali simili ad HAM/TSP. Questa differente patogenicità tra HTLV-1 e HTLV-2 è generalmente attribuita alle proprietà dei transattivatori virali Tax1 e Tax2, in grado di promuovere l’espressione genica attraverso l’attivazione delle vie di segnalazione cellulare NF-κB e ATF/CREB. Dal momento che le attività cellulari delle proteine Tax sono strettamente correlate alle loro modificazioni post-traduzionali, questo ricerca è finalizzata allo studio comparativo dei processi di ubiquitinazione e sumoilazione tra Tax1 e Tax2. 5 delle 10 lisine di Tax1, denominate da K1 a K10, sono state individuate come responsabili delle modificazioni post-traduzionali di Tax1. Più precisamente, le lisine da K4 a K8 sono essenziali per l’ubiquitinazione della molecola, mentre le lisine K7 e K8 risultano essere gli unici siti di sumoilazione. Inoltre, sia la sumoilazione che l’ubiquitinazione sono state identificate come necessarie per l’attivazione della via NF-κB da parte di Tax1 e della sua localizzazione cellulare in corpi nucleari (Nuclear Bodies, NBs) e in strutture legate all’apparato di Golgi. Per determinare il ruolo della ubiquitinazione e sumoilazione nell’attività trascrizionale di Tax2B e per identificare possibili differenze tra Tax1 e Tax2 (sottotipo B, Tax2B), sono stati prodotti mutanti lisina-arginina di Tax1 e Tax2B e analizzati per la loro capacità di attivare le vie NF-κB e CREB, sumoilazione ed ubiquitinazione e localizzazione cellulare. I risultati ottenuti mostrano differenze nei siti bersagli di sumoilazione tra Tax2B e Tax1. Più precisamente, in Tax2B altre lisine, oltre le lisine K7 e K8, sembrerebbero coinvolte nel processo di sumoilazione, dal momento che le mutazioni in Tax2B K7-8R, a differenza di quanto accade per Tax1 K7-8R, hanno minor effetto sui livelli di sumoilazione. Il segnale di sumoilazione è inoltre rilevabile nonostante la mutazione in arginina delle sei lisine centrali di Tax2B (mutante Tax2B K3ii-8R). Questi risultati fanno luce anche sulla significative differenze che vedono i mutanti Tax2 K7-8R e Tax2 K3ii-8R mantenere rispettivamente il 75% e il 25% di livelli di attivazione di NF-κB rispetto a Tax2 wild type, a differenza dei mutanti omologhi di Tax1 in cui l’attivazione di NF-κB è quasi azzerata. Il ruolo non esclusivo delle lisine K7 e K8 in Tax2B è confermato, inoltre, dalla analisi della localizzazione cellulare dei mutanti di Tax1 e Tax2B che mostra come il mutante Tax2B K7-8R si aggreghi in corpi nucleari (Nuclear Bodies, NBs), a differenza dell’omologo mutante Tax1 K7-8R. In conclusione, i risultati di questo studio indicano che, nonostante il pattern di sumoilazione di Tax2B sia differente da quello di Tax1, il meccanismo di attivazione della via NF-kB di entrambe le proteine Tax è legato allo stesso processo di sumoilazione.

The two retroviruses HTLV-1 and HTLV-2 present a very close genomic structure but differ significantly in pathogenicity. In particular, HTLV-1 is associated to Adult T-cell Leukemia, a rare and aggressive T-cell malignancy and is also the causative agent of the HTLV associated myelophaty/tropical spastic paraperesis (HAM/TSP), a progressive and disabling demyelinating neurological disease. In contrast to the case for HTLV-1, HTLV-2 has not been linked to lymphoproliferative pathologies though it appears to be correlated to rare neurological disorders similar to HAM/TSP. This difference is generally attributed to the properties of their transactivating Tax proteins, Tax1 and Tax2, both of which activate gene expression via the ATF/CREB and NF-κB pathways. Since Tax cellular role is strictly governed by post-translational modifications, this study was aimed at comparing the role of specific lysine residues in the processes of ubiquitination and sumoylation of Tax1 and Tax2. Five of ten Tax1 lysine residues, namely from K1 to K10, were found to be the major targets of Tax-1 modifications. More precisely, lysines from K4 to K8 are known to be essential for Tax1 ubiquitination, while lysine K7 and K8 are more directly involved in Tax1 sumoylation. Moreover, both ubiquitination and sumoylation of Tax1 were found to be required for NF-κB activation and localization in nuclear bodies and in Golgi-apparatus related structures. To determine whether ubiquitination and sumoylation control Tax2B transcription activity and to outline possible differences between Tax1 and Tax2B, a series of Tax lysine-to-arginine mutants were constructed and their ubiquitination and sumoylation status, their capacity to activate gene expression via the NF-κB and ATF/CREB pathways and their intracellular distribution with the corresponding Tax1 mutants were compared. The results obtained indicated a notable difference between the lysine sites involved in Tax2B sumoylation. More precisely, other Tax2B lysines appear to be involved in Tax2B sumoylation, since the mutation in Tax2B K7-8R, contrary to Tax1 K7-8R, had little effects on Tax2B sumoylation level and pattern. More importantly, when all six Tax2B central lysines were mutated to arginines, a detectable level of sumoylation was maintained. These results also explain the significant differences between Tax1 and Tax2B showing that Tax1 K7-8R and K4-8R were defective for NF-κB activation whereas the homologous Tax2B K7-8R and K3ii-8R maintained 75% and 25% of NF-κB activation. As expected , Tax1 and Tax2B mutants with substitution of all lysine residues had undetectable level of sumoylation. The non-exclusive role of lysines K7 and K8 in Tax2B sumoylation was confirmed by confocal analysis of intracellular distribution of Tax1 and Tax2B mutants showing that Tax1 K7-8R does not accumulate in nuclear bodies, whereas the homologous Tax2 K7-8R clearly shows its presence in nuclear bodies. Taken together these results indicate that though Tax2B lysine sumoylation pattern is different from that of Tax1, the NF-κB activation mechanism by the two Tax proteins is linked to the same sumoylation process.