CANDIDATE GENE ASSOCIATION ANALYSIS IN RESPIRATORY DISEASES – THE GEIRD PROJECT

L' Asma, la Rinite e la Bronco-pneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) sono malattie respiratorie comuni in tutto il mondo, caratterizzate da infiammazione cronica locale e sistemica delle vie aeree e da aumentata reattività bronchiale, che contribuiscono in modo sostanziale alla morbilità e mortalità negli adulti dei paesi occidentali. Sono malattie complesse ed eterogenee derivate dall'interazione di fattori genetici ed ambientali. Diversi geni, ciascuno con un piccolo effetto, sono verosimilmente coinvolti nello sviluppo di queste malattie e possono contribuire alla variabilità del fenotipo in relazione all’ esposizione ambientale. Molti geni sono riportati in letteratura in associazione ad una, due o tutte e tre le malattie, sebbene i risultati di questi studi non sempre sono consistenti. Questo lavoro è parte del progetto GEIRD (Gene Environment Interaction Respiratory Diseases), uno studio di popolazione caso-controllo, che ha lo scopo di chiarire il ruolo dei fattori genetici ed ambientali in sviluppo, persistenza, gravità e controllo delle malattie infiammatorie. In particolare, la tesi di dottorato qui presentata si focalizza su uno studio di associazione di geni candidati in un' ampia e ben caratterizzata popolazione di soggetti italiani, allo scopo di identificare geni di suscettibilità ad asma, rinite e BPCO e geni di suscettibilità che possono essere comuni alle tre patologie. Un totale di 1175 soggetti, comprendenti soggetti affetti da Asma, Rinite e BPCO (casi) e soggetti non affetti da malattie infiammatorie delle vie aeree (controlli) sono stai arruolati nello studio. E' stata creata una banca di DNA di questi soggetti coinvolti. I geni candidati per lo studio sono stati scelti sulla base dei dati di letteratura, considerando studi di singoli geni, GWAS (studi di scansione sull’ intero genoma) e meta-analisi. È stato selezionato un gruppo di 69 geni coinvolti in processi biologici potenzialmente correlati con le patologie oggetto dello studio, quali l'infiammazione, l'immunità innata, l' immuno-regolazione, lo stress ossidativo, il metabolismo degli xenobiotici, la regolazione dell' equilibrio proteasi-antiproteasi e il rimodellamento tissutale. Un pannello di 384 “Tag-SNP”, rappresentative dei geni candidati oggetto dello studio, è stato sviluppato per l’ analisi con il sistema di genotipizzazione multipla GoldenGate (Illumina). È stato effettuato uno studio di associazione a singolo locus e a loci multipli per valutare l'associazione con i seguenti fenotipi: asma corrente, asma passato, asma totale, asma atopico corrente, rinite allergica e non allergica, rinite totale, e presenza di sintomi respiratori cronici. Una associazione statisticamente significativa (p<0,01) è stata osservata fra il gene IL-13(5q31) e l’ asma passato, i geni SPINK-5 (5q31-q32) e GSTP-1 (11q13) e la rinite non atopica, il gene NOS-1 (12q24.2) e la presenza di sintomi respiratori cronici. Un dato interessante che è emerso da questo studio è la presenza di associazione di polimorfismi nel gene IL1RL-2 (2q12) con più fenotipi (asma corrente, asma atopico corrente, presenza di sintomi respiratori cronici, rinite non allergica, e rinite totale) suggerendo un possibile ruolo di questo gene in tutte le patologie respiratorie studiate. È stato approfondito lo studio per questi geni mediante un’ analisi di associazione degli aplotipi. Questo ulteriore studio ha confermato le associazioni trovate nell’ analisi a singolo locus e il coinvolgimento dei geni IL-13, SPINK-5, GSTP-1, NOS-1 e IL1RL-2 nella suscettibilità alle malattie respiratorie infiammatorie. I risultati di questo studio potranno essere utilizzati in futuro per lo sviluppo di nuovi test genetici molecolari per l’identificazione precoce di sottogruppi di pazienti che necessitano di terapie specifiche o che hanno una suscettibilità individuale a specifici fattori di rischio ambientale mediante la determinazione del loro profilo di rischio genetico. Nell’era post-genomica, la ricerca e l’identificazione dei geni associati alle malattie complesse sono ancora una delle principali sfide per la comprensione profonda delle malattie umane complesse. Una migliore conoscenza dei meccanismi patogenetici e l'identificazione di marcatori molecolari di malattia e di profili genomici associati a particolari manifestazioni della malattia e al decorso clinico, offrirà nuovi bersagli per la terapia farmacologica e aprirà la strada a possibili applicazioni future per il trattamento e la prevenzione delle malattie, per mezzo di una definizione più accurata della prognosi e dello sviluppo di terapie più specifiche o addirittura individuali.

Asthma, Rhinitis and Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) are common respiratory diseases worldwide, characterized by systemic and local chronic inflammation of the airways and increasing bronchial responsiveness, that contribute substantially to morbidity and mortality in adults living in the developed world. They are complex and heterogeneous diseases resulting from interaction between genetic and environmental factors. Several genes, each with a small effect, are likely involved in the development of these diseases and might contribute to the phenotype variability according to environmental exposure. Many candidate genes are reported in the literature data in association to one, two or all three diseases, even if results of these studies are not always consistent. This work is a part of the GEIRD (Gene Environment Interaction Respiratory Diseases) project, a population-based case-control study, aimed to elucidate the role of environment and genetic factors in the occurrence, persistence, severity and control of inflammatory airway diseases. In particular, the PhD thesis project here presented is focused on candidate gene association analysis in a large and accurately defined series of Italian subjects, in order to identify genes involved in the susceptibility to Asthma, Rhinitis and COPD and susceptibility genes that may be common to all the three diseases. A total of 1175 individuals, including subjects affected by asthma, rhinitis and COPD (cases) and unaffected by airways inflammatory diseases (controls), have been enrolled. A DNA bank, from all the subjects participating to the study, was created. Candidate genes for the study was chosen on the basis of the analysis of literature data, considering single genes studies, GWAS and meta-analyses. A group of 69 genes, involved in pathways related to the all three studied diseases, as inflammation, innate immunity and immunoregulation, oxidative stress and metabolism of xenobiotics, regulation of the protease-antiprotease equilibrium, and tissue remodelling, were selected. A panel of 384 Tag SNPs, representative of the candidate genes, was genotyped by a customized multiplexed GoldenGate Genotyping assay (Illumina). A single-locus and multi-locus association analysis was conducted to evaluate association with the following phenotypes: current asthma, past asthma, total asthma (current and past), current atopic asthma, allergic rhinitis, non allergic rhinitis, total rhinitis (allergic and non allergic), and subjects presenting with chronic respiratory symptoms. A significant association (p<0,01) was observed between IL-13 (5q31) and past asthma, both SPINK-5 (5q31-q32) and GSTP-1 (11q13) and non-atopic rhinitis, NOS-1 (12q24.2-24.31) and chronic respiratory symptoms. More interestingly, polymorphisms in IL1RL-2 gene (2q12) were found associated to multiple phenotypes (current asthma, current atopic asthma, chronic respiratory symptoms, non atopic rhinitis, and total rhinitis) suggesting a possible role for this gene in all the studied respiratory diseases. Therefore, we decide to deepen the study performing an haplotype association analysis for these genes. This additional study confirmed the single-locus associations found and the involvement of IL-13, SPINK-5, GSTP-1, NOS-1 and IL1RL-2 genes in the susceptibility to inflammatory respiratory diseases. The results of this study can be used in the future for the development of new molecular genetic tests for the early identification of subgroups of patients who need a specific therapy or having an individual susceptibility to specific environmental risk factors, by the determination of their genetic risk profile. In the post-genomic era, searching and identification of genes associated with complex diseases are still one of the main challenges for dissecting human complex diseases. A better understanding of pathogenic mechanisms and the identification of molecular markers of disease and genomic profiles, associated to particular diseases phenotypes and clinical outcomes, will be offering new targets for pharmacological therapy and will be opening the way to possible future applications in disease treatment and prevention, by a more accurate prognosis determination and a more specific or even individual therapies.