La mesotelina è una glicoproteina di superfice cellulare sintetizzata a partire da un precursore di 71 kDa che viene processato in un frammento di 40 kDa legato alla membrana ed un fattore solubile potenziante i megacariociti di 31 KDa. La mesotelina rappresenta un promettente biomarcatore tumorale; in condizioni fisiologiche è espressa dalle cellule mesoteliali delle sierose dell’organismo (pleura, pericardio e peritoneo) mentre è overespressa sulla superficie cellulare di diversi istotipi tumorali tra cui: il mesotelioma maligno, il carcinoma ovarico, pancreatico e polmonare. La sua funzione è sconosciuta ma recentemente è stato ipotizzato un suo ruolo nei meccanismi di adesione cellulare attraverso il legame all’antigene tumorale CA125. La limitata espressione della mesotelina a livello dei tessuti fisiologici e, di contro, l’elevata espressione in molti tumori, rendono questo antigene un possibile target nella immunoterapia anti-tumorale. Il presente lavoro descrive la generazione di un nuovo anticorpo monoclonale anti-mesotelina ottenuto mediante la tecnologia degli ibridomi e la caratterizzazione delle sue proprietà di riconoscimento. Tale anticorpo monoclonale è stato testato per valutare un suo potenziale utilizzo terapeutico e diagnostico. L’anticorpo anti-mesotelina ha dimostrato, in analisi condotte mediante citofluorimetria, una notevole specificità, essendo in grado di riconoscere cellule che esprimono l’antigene mesotelina costitutivamente (OVCAR-3) e per trasfezione (HEK293-mesotelina); allo stesso tempo l’anticorpo ottenuto non possiede la capacità di legare cellule mesotelina negative. La specificità di riconoscimento in vitro è paragonabile all’anticorpo monoclonale commerciale K1 da noi utilizzato come controllo positivo. Studi di binding, inoltre, hanno permesso di evidenziare la migliore affinità del nostro anticorpo rispetto all’anticorpo monoclonale commerciale K1. Basandoci su questi dati abbiamo sviluppato uno immunotossina chimica con le capacità di riconoscimento del nostro anticorpo e l’attivita citotossica della ricina (una potente tossina appartenente alla famiglia delle proteine inattivanti i ribosomi) con lo scopo di poter utilizzare tale costrutto nella immunoterapia passiva di tumori overesprimenti la mesotelina. Le frazioni raccolte e purificate dell’immunotossina, ottenute mediante la produzione di un ponte disolfuro tra l’anticorpo monoclonale e la ricina, risultano capaci di inibire del 50% la proliferazione cellulare (IC50). Tale attività citotossica si manifesta su cellule mesotelina positive ad una concentrazione di 0,03 nM e 0,09 nM rispettivamente a 36 h e 72 h di incubazione. Inoltre il nostro costrutto dimostra una elevata specificità di riconoscimento in quanto non sono stati raggiunti valori di IC50 su cellule mesotelina-negative anche dopo aggiunta di concentrazioni pari o superiori a 78 nM dell’immunotossina. Si è infine osservato che l’attività citotossica di una concentrazione pari a 0,03 nM dell’immunotossina è completamente neutralizzata dalla contemporanea aggiunta, nel terreno di coltura, dell’ anticorpo anti-mesotelina da noi generato ad una concentrazione 1000 volte maggiore rispetto a quella dell’immunotossina. Questo ultimo dato supporta i precedenti ottenuti potenziando l’evidenza di una attività citotossica specifica e anticorpo mediata da parte della nostra immunotossina chimica.

BACKGROUND: Mesothelin is a tumor differentiation antigen (Ag) that is normally present on the mesothelial cells lining the pleura, peritoneum and pericardium. It is, however, highly expressed in several human cancers including malignant mesothelioma, pancreatic, ovarian and lung adenocarcinoma. The normal biologic function of mesothelin is unknown but recent studies have shown that it binds to CA-125 and may play a role in the peritoneal spread of ovarian cancer. The limited mesothelin expression in normal tissues and high expression in many cancers makes it an attractive candidate for cancer immunotherapy. RESULTS: In this study we have developed a monoclonal antibody (mAb) that is specific for the Ag mesothelin. It was produced by hybridomas technologies and we have performed Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) analysis to evaluate the specificity and affinity of this antibody for the Ag of interest. The mAb binds mesothelin-positive cell lines expressing the Ag constitutively (OVCAR-3) and transfected cells (HEK293-mesothelin). The same mAb not recognizes mesothelin-negative cell lines demonstrating an high specificity in vitro. Binding studies have demonstrated that our mAb has a better affinity with respect to mAb K1, a commercially available anti-mesothelin mAb. Our anti-mesothelin mAb was chemically linked to ricin A chain (RTA) toxin obtaining a powerful immunodelivered drug (immunotoxin, IT) with specific cytotoxic activity on mesothelin positive cells; in a cytotoxic assay on HEK293-mesothelin transfected cells the anti-mesothelin mAb-RTA IT shows an IC50 of 0.03 nM and 0,09 nM after 36 hrs and 72 hrs of incubation respectively; no cytotoxic activity was observed against mock-not transfected one and other mesothelin negative cells. As a further proof of specificity we observed that the cytotoxic activity of 0,03 nM of the above-mentionated IT on HEK293-mesothelin cells, is fully prevented by addition of whole molecule mesothelin-specific antibody at a concentration 1000 fold over IT. CONCLUSION: Our mAb holds great potential to be used as a research reagent and diagnostic tool in research laboratories and in the clinics because of its high quality and versatility. This antibody is also a strong candidate to be investigated for further in vivo passive immunotherapy studies. Moreover, the discovered of this new mAb anti-mesothelin enable us to develop in vivo diagnostic approaches using radionuclide, fluorescence trackers or nanoparticles. Its conjugation with therapeutic molecules allows a better distribution of the drug to the tumor sites; this ability increase the antitumor efficacy and reduce the specific toxicity at the same time.

Development of biologic devices for mesothelin immunotargeting

ELEUTERI, Stefano
2012

Abstract

La mesotelina è una glicoproteina di superfice cellulare sintetizzata a partire da un precursore di 71 kDa che viene processato in un frammento di 40 kDa legato alla membrana ed un fattore solubile potenziante i megacariociti di 31 KDa. La mesotelina rappresenta un promettente biomarcatore tumorale; in condizioni fisiologiche è espressa dalle cellule mesoteliali delle sierose dell’organismo (pleura, pericardio e peritoneo) mentre è overespressa sulla superficie cellulare di diversi istotipi tumorali tra cui: il mesotelioma maligno, il carcinoma ovarico, pancreatico e polmonare. La sua funzione è sconosciuta ma recentemente è stato ipotizzato un suo ruolo nei meccanismi di adesione cellulare attraverso il legame all’antigene tumorale CA125. La limitata espressione della mesotelina a livello dei tessuti fisiologici e, di contro, l’elevata espressione in molti tumori, rendono questo antigene un possibile target nella immunoterapia anti-tumorale. Il presente lavoro descrive la generazione di un nuovo anticorpo monoclonale anti-mesotelina ottenuto mediante la tecnologia degli ibridomi e la caratterizzazione delle sue proprietà di riconoscimento. Tale anticorpo monoclonale è stato testato per valutare un suo potenziale utilizzo terapeutico e diagnostico. L’anticorpo anti-mesotelina ha dimostrato, in analisi condotte mediante citofluorimetria, una notevole specificità, essendo in grado di riconoscere cellule che esprimono l’antigene mesotelina costitutivamente (OVCAR-3) e per trasfezione (HEK293-mesotelina); allo stesso tempo l’anticorpo ottenuto non possiede la capacità di legare cellule mesotelina negative. La specificità di riconoscimento in vitro è paragonabile all’anticorpo monoclonale commerciale K1 da noi utilizzato come controllo positivo. Studi di binding, inoltre, hanno permesso di evidenziare la migliore affinità del nostro anticorpo rispetto all’anticorpo monoclonale commerciale K1. Basandoci su questi dati abbiamo sviluppato uno immunotossina chimica con le capacità di riconoscimento del nostro anticorpo e l’attivita citotossica della ricina (una potente tossina appartenente alla famiglia delle proteine inattivanti i ribosomi) con lo scopo di poter utilizzare tale costrutto nella immunoterapia passiva di tumori overesprimenti la mesotelina. Le frazioni raccolte e purificate dell’immunotossina, ottenute mediante la produzione di un ponte disolfuro tra l’anticorpo monoclonale e la ricina, risultano capaci di inibire del 50% la proliferazione cellulare (IC50). Tale attività citotossica si manifesta su cellule mesotelina positive ad una concentrazione di 0,03 nM e 0,09 nM rispettivamente a 36 h e 72 h di incubazione. Inoltre il nostro costrutto dimostra una elevata specificità di riconoscimento in quanto non sono stati raggiunti valori di IC50 su cellule mesotelina-negative anche dopo aggiunta di concentrazioni pari o superiori a 78 nM dell’immunotossina. Si è infine osservato che l’attività citotossica di una concentrazione pari a 0,03 nM dell’immunotossina è completamente neutralizzata dalla contemporanea aggiunta, nel terreno di coltura, dell’ anticorpo anti-mesotelina da noi generato ad una concentrazione 1000 volte maggiore rispetto a quella dell’immunotossina. Questo ultimo dato supporta i precedenti ottenuti potenziando l’evidenza di una attività citotossica specifica e anticorpo mediata da parte della nostra immunotossina chimica.
Cancer immunotherapy; mesothelin targeted cancer immunotherapy; therapeutic potential of anticancer immunotoxins
BACKGROUND: Mesothelin is a tumor differentiation antigen (Ag) that is normally present on the mesothelial cells lining the pleura, peritoneum and pericardium. It is, however, highly expressed in several human cancers including malignant mesothelioma, pancreatic, ovarian and lung adenocarcinoma. The normal biologic function of mesothelin is unknown but recent studies have shown that it binds to CA-125 and may play a role in the peritoneal spread of ovarian cancer. The limited mesothelin expression in normal tissues and high expression in many cancers makes it an attractive candidate for cancer immunotherapy. RESULTS: In this study we have developed a monoclonal antibody (mAb) that is specific for the Ag mesothelin. It was produced by hybridomas technologies and we have performed Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) analysis to evaluate the specificity and affinity of this antibody for the Ag of interest. The mAb binds mesothelin-positive cell lines expressing the Ag constitutively (OVCAR-3) and transfected cells (HEK293-mesothelin). The same mAb not recognizes mesothelin-negative cell lines demonstrating an high specificity in vitro. Binding studies have demonstrated that our mAb has a better affinity with respect to mAb K1, a commercially available anti-mesothelin mAb. Our anti-mesothelin mAb was chemically linked to ricin A chain (RTA) toxin obtaining a powerful immunodelivered drug (immunotoxin, IT) with specific cytotoxic activity on mesothelin positive cells; in a cytotoxic assay on HEK293-mesothelin transfected cells the anti-mesothelin mAb-RTA IT shows an IC50 of 0.03 nM and 0,09 nM after 36 hrs and 72 hrs of incubation respectively; no cytotoxic activity was observed against mock-not transfected one and other mesothelin negative cells. As a further proof of specificity we observed that the cytotoxic activity of 0,03 nM of the above-mentionated IT on HEK293-mesothelin cells, is fully prevented by addition of whole molecule mesothelin-specific antibody at a concentration 1000 fold over IT. CONCLUSION: Our mAb holds great potential to be used as a research reagent and diagnostic tool in research laboratories and in the clinics because of its high quality and versatility. This antibody is also a strong candidate to be investigated for further in vivo passive immunotherapy studies. Moreover, the discovered of this new mAb anti-mesothelin enable us to develop in vivo diagnostic approaches using radionuclide, fluorescence trackers or nanoparticles. Its conjugation with therapeutic molecules allows a better distribution of the drug to the tumor sites; this ability increase the antitumor efficacy and reduce the specific toxicity at the same time.
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