In tutto il mondo si sta assistendo ad un aumento dell’incidenza di isolati clinici di Enterobacteriaceae resistenti ai fluorochinoloni. La resistenza può essere dovuta ad un accumulo di mutazioni cromosomiche a livello dei geni che codificano le topoisomerasi, bersaglio d’azione dei fluorochinoloni; mediata da determinanti plasmidici, in particolare quelli che codificano per proteine di protezione Qnr, per l’enzima di acetilazione aac(6’)-Ib-cr e per le pompe di efflusso QepA e OqxAB. Tutti questi determinanti da soli conferiscono al batterio bassi livelli di resistenza ma consentono un aumento della frequenza di mutazione,facilitando la selezione di alti livelli di resistenza. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di valutare l’incidenza della presenza di determinanti plasmidici che mediano la resistenza ai fluorochinoloni (PMQR), in una collezione di isolati clinici di Enterobacteriaceae provenienti da vari laboratori del nord-est Italia. Tutti i ceppi risultati positivi per la presenza di questi determinanti sono stati caratterizzati dal punto di vista plasmidico e correlati alla presenza di geni che codificano per beta-lattamasi. Sono stati raccolti 756 isolati clinici di enterobatteri: 497 Escherichia coli, 68 Klebsiella spp., 18 Citrobacter spp., 69 Proteus spp., 24 Morganella spp., 21 Providencia spp., 52 Enterobacter spp. and 7 Serratia marcescens. Per tutti i ceppi sono stati eseguiti i saggi di sensibilità con il metodo della microdiluizione a ciprofloxacina e levofloxacina, ottenendo valori di MIC variabili da 0.06 a 128 µg/ml. Lo screening dei PMQR mediante PCR ha evidenziato 108 positivi (38 qnr e 70 aac(6’)-Ib-cr) su 104 isolati. L’analisi delle sequenze degli ampliconi ha permesso di classificare le varianti qnr in 26 qnrS1, 2 qnrB2, 2 qnrB6, 2 qnrB8, 1 qnrB19 e 5 qnrD. Per quest’ultimo determinante sono risultati positivi 4 P. mirabilis e una M. morganii verificandone la localizzazione plasmidica con Southern blot e ottenendo la sequenza completa mediante PCR inversa (2687 bp per P. mirabilis e 2684 bp per M. morganii depositate in Genbank con i numeri di accesso JN183060 and JN183061). I ceppi positivi per qnrS1 erano suddivisi in 10 E. coli, 15 Klebsiella spp. e un P. mirabilis. In questi ceppi qnrS1 era accompagnato da VIM-1, SHV-12 e LAP-2. I 4 E. coli che ospitavano sia qnrS1 che aac(6’)-Ib-cr ospitavano anche CTX-M-15, OXA-1 and TEM-1. I plasmidi dei positivi sono stati caratterizzati con il metodo dell’origine della replicazione. I ceppi qnrS1 ospitano questo gene su plasmidi di tipo incN. Con esperimenti di coniugazione si è visto che il plasmide con qnrS1 e VIM-1 è coniugabile. Inoltre, nei tre ceppi di K. pneumoniae ST147 con qnrS1 e blaLAP-2 si è dimostrato che questi sono integrati nello stesso contesto genetico di ISEcl2. I 70 ceppi che presentano la variante aac(6’)-Ib-cr erano suddivisi in 60 E. coli, 8 Klebsiella spp., 1 P. mirabilis e 1 M. morganii. La tipizzazione dei plasmidi ha messo in evidenza i tipi incFia e incF sia in E. coli che P. mirabilis, mentre incColE era predominante in Klebsiella spp. e M. morganii era caratterizzata da un plasmide non tipizzabile. Si è inoltre evidenziata una alta correlazione fra la variante aac(6)-Ib-cr e le beta-lattamasi OXA-1 e CTX-M-15 sia in E. coli (42/60), che in Klebsiella spp. (8/8), con l’eccezione di P. mirabilis dove invece con OXA-1 è presente TEM-52. Dalla nostra indagine è emersa una prevalenza di determinanti plasmidici che mediano la resistenza ai fluorochinoloni del 13.7% (104/756). Solo il 13.1% (5/38) degli isolati positivi per il qnr risultano in un range di bassa resistenza, mentre i ceppi positivi per la variante aac(6’)-Ib-cr presentavano tutti alti livelli di resistenza. La nostra indagine ha consentito di descrivere il primo determinante qnrD isolato in Europa e la prima beta-lattamasi LAP-2 isolata in Italia.

Clinical isolates of fluoroquinolone-resistant Enterobacteriaceae are emerging worldwide. The traditional resistance mechanism is the accumulation of mutations in the chromosome coding for the target molecules of fluoroquinolone. All known plasmid-mediated quinolone resistance determinants - namely, Qnr determinants, aac(6’)-Ib-cr enzyme, qepA and oqxAB efflux pumps - can individually confer low-level resistance. In this condition, bacterial cells have increased mutation frequency, making it easier the selection of higher-level fluoroquinolone resistance. Our aims were to survey for plasmid-mediated quinolone resistance determinants a collection of Enterobacteriaceae clinical isolates originating from clinical microbiological laboratories of North-East Italy, and to characterize both the resistant strains and the plasmids harbouring quinolone resistance determinants and beta-lactamase genes. Altogether, 756 Enterobacteriaceae clinical isolates were collected: 497 Escherichia coli, 68 Klebsiella spp., 18 Citrobacter spp., 69 Proteus spp., 24 Morganella spp., 21 Providencia spp., 52 Enterobacter spp. and 7 Serratia marcescens. MIC values were determined by microdilution for ciprofloxacin and levofloxacin, showing values between 0.06 and 128 µg/ml. Screening by PCR for plasmid-mediated quinolone resistance determinants yielded 108 positives [38 qnr and 70 aac(6’)-Ib-cr] out of 104 isolates. Sequencing and analysis of PCR-positive products verified: 26 qnrS1, 2 qnrB2, 2 qnrB6, 2 qnrB8, 1 qnrB19 and 5 qnrD. Four Proteus mirabilis and one Morganella morganii isolates were qnrD positive. Plasmid extraction was performed, and Southern blot analysis verified the plasmid localization of the qnrD determinants. Inverse PCR-based sequencing of qnrD-harbouring plasmids, resulted in a 2687 bp and 2684 bp plasmid DNA for Proteus mirabilis and Morganella morganii, respectively. Both plasmid sequences are deposited at Genbank with accession numbers JN183060 and JN183061. Among the qnrS1 positive isolates, 10 E. coli, 15 Klebsiella spp. and one Proteus mirabilis were detected. Detection of beta-lactamase genes by PCR and sequencing yielded: 6 VIM-1, 7 SHV-12 and 3 LAP-2 positives. All four qnrS1 E. coli with the aac(6’)-Ib-cr variant were CTX-M-15, OXA-1 and TEM-1 positive. PCR-based replicon typing found incN type plasmid to be the most prevalent. Conjugation experiment found 3 qnrS1 and VIM-1 harbouring conjugable plasmids. We could also demonstrate in three Klebsiella pneumoniae ST147 strains that qnrS1 and blaLAP-2 are integrated in the same ISEcl2 genetic context. Southern blot verified that the qnrS1 gene is localized on incN or untypable plasmids. Altogether 70 aac(6’)-Ib-cr variant positive isolates were found: 60 E. coli, 8 Klebsiella spp., one P.mirabilis and one M.morganii. Replicon typing of plasmids found incFia and incF types to be common for E. coli and P. mirabilis while incColE type to be predominant in Klebsiella spp., whilst M.morganii was untypeable. A high correlation of the aac(6)-Ib-cr variant with OXA-1 and CTX-M-15 beta-lactamases was found in E. coli (42/60) and in Klebsiella spp. (8/8), whilst in P. mirabilis the aac(6)-Ib-cr variant was associated with TEM-52 and OXA-1. Our survey for plasmid-mediated quinolone resistance determinants found a 13.7% prevalence (104/756). MIC values for ciprofloxacin and levofloxacin showed uneven resistance levels among the qnr-positive isolates, with only 13.1% of strains (5/38) in the range of low-level resistance, while in case of the aac(6’)-Ib-cr variant all positive isolates were resistant to fluoroquinolones. Our survey found the first qnrD determinants in Europe, and we could also demonstrate the first LAP-2 beta-lactamase in Italy.

Plasmid-mediated fluoroquinolone resistance in Enterobacteriaceae

KOCSIS, Bela
2012

Abstract

In tutto il mondo si sta assistendo ad un aumento dell’incidenza di isolati clinici di Enterobacteriaceae resistenti ai fluorochinoloni. La resistenza può essere dovuta ad un accumulo di mutazioni cromosomiche a livello dei geni che codificano le topoisomerasi, bersaglio d’azione dei fluorochinoloni; mediata da determinanti plasmidici, in particolare quelli che codificano per proteine di protezione Qnr, per l’enzima di acetilazione aac(6’)-Ib-cr e per le pompe di efflusso QepA e OqxAB. Tutti questi determinanti da soli conferiscono al batterio bassi livelli di resistenza ma consentono un aumento della frequenza di mutazione,facilitando la selezione di alti livelli di resistenza. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di valutare l’incidenza della presenza di determinanti plasmidici che mediano la resistenza ai fluorochinoloni (PMQR), in una collezione di isolati clinici di Enterobacteriaceae provenienti da vari laboratori del nord-est Italia. Tutti i ceppi risultati positivi per la presenza di questi determinanti sono stati caratterizzati dal punto di vista plasmidico e correlati alla presenza di geni che codificano per beta-lattamasi. Sono stati raccolti 756 isolati clinici di enterobatteri: 497 Escherichia coli, 68 Klebsiella spp., 18 Citrobacter spp., 69 Proteus spp., 24 Morganella spp., 21 Providencia spp., 52 Enterobacter spp. and 7 Serratia marcescens. Per tutti i ceppi sono stati eseguiti i saggi di sensibilità con il metodo della microdiluizione a ciprofloxacina e levofloxacina, ottenendo valori di MIC variabili da 0.06 a 128 µg/ml. Lo screening dei PMQR mediante PCR ha evidenziato 108 positivi (38 qnr e 70 aac(6’)-Ib-cr) su 104 isolati. L’analisi delle sequenze degli ampliconi ha permesso di classificare le varianti qnr in 26 qnrS1, 2 qnrB2, 2 qnrB6, 2 qnrB8, 1 qnrB19 e 5 qnrD. Per quest’ultimo determinante sono risultati positivi 4 P. mirabilis e una M. morganii verificandone la localizzazione plasmidica con Southern blot e ottenendo la sequenza completa mediante PCR inversa (2687 bp per P. mirabilis e 2684 bp per M. morganii depositate in Genbank con i numeri di accesso JN183060 and JN183061). I ceppi positivi per qnrS1 erano suddivisi in 10 E. coli, 15 Klebsiella spp. e un P. mirabilis. In questi ceppi qnrS1 era accompagnato da VIM-1, SHV-12 e LAP-2. I 4 E. coli che ospitavano sia qnrS1 che aac(6’)-Ib-cr ospitavano anche CTX-M-15, OXA-1 and TEM-1. I plasmidi dei positivi sono stati caratterizzati con il metodo dell’origine della replicazione. I ceppi qnrS1 ospitano questo gene su plasmidi di tipo incN. Con esperimenti di coniugazione si è visto che il plasmide con qnrS1 e VIM-1 è coniugabile. Inoltre, nei tre ceppi di K. pneumoniae ST147 con qnrS1 e blaLAP-2 si è dimostrato che questi sono integrati nello stesso contesto genetico di ISEcl2. I 70 ceppi che presentano la variante aac(6’)-Ib-cr erano suddivisi in 60 E. coli, 8 Klebsiella spp., 1 P. mirabilis e 1 M. morganii. La tipizzazione dei plasmidi ha messo in evidenza i tipi incFia e incF sia in E. coli che P. mirabilis, mentre incColE era predominante in Klebsiella spp. e M. morganii era caratterizzata da un plasmide non tipizzabile. Si è inoltre evidenziata una alta correlazione fra la variante aac(6)-Ib-cr e le beta-lattamasi OXA-1 e CTX-M-15 sia in E. coli (42/60), che in Klebsiella spp. (8/8), con l’eccezione di P. mirabilis dove invece con OXA-1 è presente TEM-52. Dalla nostra indagine è emersa una prevalenza di determinanti plasmidici che mediano la resistenza ai fluorochinoloni del 13.7% (104/756). Solo il 13.1% (5/38) degli isolati positivi per il qnr risultano in un range di bassa resistenza, mentre i ceppi positivi per la variante aac(6’)-Ib-cr presentavano tutti alti livelli di resistenza. La nostra indagine ha consentito di descrivere il primo determinante qnrD isolato in Europa e la prima beta-lattamasi LAP-2 isolata in Italia.
Fluoroquinolone resistance; plasmid; beta-lactamase; Enterobacteriaceae
Clinical isolates of fluoroquinolone-resistant Enterobacteriaceae are emerging worldwide. The traditional resistance mechanism is the accumulation of mutations in the chromosome coding for the target molecules of fluoroquinolone. All known plasmid-mediated quinolone resistance determinants - namely, Qnr determinants, aac(6’)-Ib-cr enzyme, qepA and oqxAB efflux pumps - can individually confer low-level resistance. In this condition, bacterial cells have increased mutation frequency, making it easier the selection of higher-level fluoroquinolone resistance. Our aims were to survey for plasmid-mediated quinolone resistance determinants a collection of Enterobacteriaceae clinical isolates originating from clinical microbiological laboratories of North-East Italy, and to characterize both the resistant strains and the plasmids harbouring quinolone resistance determinants and beta-lactamase genes. Altogether, 756 Enterobacteriaceae clinical isolates were collected: 497 Escherichia coli, 68 Klebsiella spp., 18 Citrobacter spp., 69 Proteus spp., 24 Morganella spp., 21 Providencia spp., 52 Enterobacter spp. and 7 Serratia marcescens. MIC values were determined by microdilution for ciprofloxacin and levofloxacin, showing values between 0.06 and 128 µg/ml. Screening by PCR for plasmid-mediated quinolone resistance determinants yielded 108 positives [38 qnr and 70 aac(6’)-Ib-cr] out of 104 isolates. Sequencing and analysis of PCR-positive products verified: 26 qnrS1, 2 qnrB2, 2 qnrB6, 2 qnrB8, 1 qnrB19 and 5 qnrD. Four Proteus mirabilis and one Morganella morganii isolates were qnrD positive. Plasmid extraction was performed, and Southern blot analysis verified the plasmid localization of the qnrD determinants. Inverse PCR-based sequencing of qnrD-harbouring plasmids, resulted in a 2687 bp and 2684 bp plasmid DNA for Proteus mirabilis and Morganella morganii, respectively. Both plasmid sequences are deposited at Genbank with accession numbers JN183060 and JN183061. Among the qnrS1 positive isolates, 10 E. coli, 15 Klebsiella spp. and one Proteus mirabilis were detected. Detection of beta-lactamase genes by PCR and sequencing yielded: 6 VIM-1, 7 SHV-12 and 3 LAP-2 positives. All four qnrS1 E. coli with the aac(6’)-Ib-cr variant were CTX-M-15, OXA-1 and TEM-1 positive. PCR-based replicon typing found incN type plasmid to be the most prevalent. Conjugation experiment found 3 qnrS1 and VIM-1 harbouring conjugable plasmids. We could also demonstrate in three Klebsiella pneumoniae ST147 strains that qnrS1 and blaLAP-2 are integrated in the same ISEcl2 genetic context. Southern blot verified that the qnrS1 gene is localized on incN or untypable plasmids. Altogether 70 aac(6’)-Ib-cr variant positive isolates were found: 60 E. coli, 8 Klebsiella spp., one P.mirabilis and one M.morganii. Replicon typing of plasmids found incFia and incF types to be common for E. coli and P. mirabilis while incColE type to be predominant in Klebsiella spp., whilst M.morganii was untypeable. A high correlation of the aac(6)-Ib-cr variant with OXA-1 and CTX-M-15 beta-lactamases was found in E. coli (42/60) and in Klebsiella spp. (8/8), whilst in P. mirabilis the aac(6)-Ib-cr variant was associated with TEM-52 and OXA-1. Our survey for plasmid-mediated quinolone resistance determinants found a 13.7% prevalence (104/756). MIC values for ciprofloxacin and levofloxacin showed uneven resistance levels among the qnr-positive isolates, with only 13.1% of strains (5/38) in the range of low-level resistance, while in case of the aac(6’)-Ib-cr variant all positive isolates were resistant to fluoroquinolones. Our survey found the first qnrD determinants in Europe, and we could also demonstrate the first LAP-2 beta-lactamase in Italy.
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