L'aterosclerosi, un processo sistemico patologico, è la causa fondamentale della maggior parte degli eventi cardiovascolari, come ictus e infarto del miocardio. L'infiammazione gioca un ruolo centrale nello sviluppo della malattia aterosclerotica, dalle prime fasi di formazione della lesione alla rottura della placca, causa principale delle sindromi acute ischemiche. La prostaglandina E2 (PGE2) è un prostanoide implicato in varie patologie, la cui concentrazione risulta elevata nel processo infiammatorio. La ciclossigenasi (COX) e la prostaglandina E sintasi (PGES) sono gli enzimi responsabili della sintesi di PGE2. In questo lavoro di tesi abbiamo investigato se geni della via COX-2/PGE2 dipendente possono essere differenzialmente espressi nelle placche carotidee e nel sangue periferico di pazienti sintomatici rispetto a pazienti asintomatici. Al fine di valutare se i geni sovraespressi nel sangue periferico di pazienti con ictus siano specificamente associati all’ictus ischemico aterotrombotico, abbiamo analizzato l'espressione di questi geni anche in pazienti con ictus cardioembolico. Abbiamo indagato, inoltre, se polimorfismi specifici nella regione del promotore dei geni up-regolati possano influenzarne l’espressione. Mediante Real Time PCR è stata analizzata l’espressione dei geni COX-2, TLR4, ACE, EP4, EP3, EPRAP e FACL4 e la loro correlazione è stata studiata mediante coefficiente di Pearson e modelli di regressione lineare. Da questo studio è emerso che i geni TLR4 e COX-2 sono sovra espressi nel sangue periferico di pazienti sintomatici e la loro espressione è risultata fortemente correlata. Entrambi i geni sono sovra regolati specificatamente nei pazienti con ictus aterotrombotico. Il polimorfismo -2604G>A è risultato associato ai livelli di espressione del gene TLR4 nel sangue periferico. In particolare, la presenza dell’allele -2604A in omozigosi porta ad una diminuzione dell’espressione genica. Analisi in silico hanno evidenziato che allele -2604A crea un sito di legame putativo per GATA-2, un regolatore negativo della trascrizione. Nonostante questi risultati debbano essere confermati in studi indipendenti, essi suggeriscono che il meccanismo periferico di danno infiammatorio dopo evento ischemico aterotrombotico può essere mediato da TLR4 attraverso una via COX-2-dipendente. Inoltre, la specificità di entrambi i geni per l'ictus di origine aterotrombotico indica che l'analisi della loro espressione genica nel sangue periferico potrebbe essere usata come biomarker per la diagnosi del sottotipo di ictus. La deregolazione del gene TLR4 potrebbe essere influenzata dalla presenza del polimorfismo -2604G>A in pazienti aterosclerotici. Studi caso/controllo in popolazioni più grandi saranno necessari per determinare se questa variazione possa rappresentare un fattore di rischio per l'aterosclerosi.

Atherosclerosis, a systemic pathological process, is the underlying cause of the majority of clinical cardiovascular events, such as stroke and myocardial infarction. Inflammation plays a central role in the development of atherosclerotic disease, from the early phases of lesion formation to plaque disruption, the main underlying cause of acute ischemic syndromes. Prostaglandin E2 (PGE2) is a prostanoid implicated in a variety of pathologies, whose concentration is elevated in inflammatory process. Cyclooxygenase (COX) and Prostaglandin E Synthase (PGES) are enzymes responsible for PGE2 synthesis. In this work we investigated if genes of COX-2/PGE2 pathway could be differentially expressed in carotid plaques and peripheral blood of symptomatic compared to asymptomatic patients. In order to evaluate if upregulated genes in peripheral blood of stroke patients may be specifically associated to atherothrombotic ischemic stroke, we analyzed expression of these genes also in cardioembolic stroke patients. Moreover, we investigated if specific polymorphisms in the promoter region of the upregulated genes could influence their expression. Expression of COX-2, TLR4, ACE, EP4, EP3, EPRAP and FACL4 genes was analyzed by Real Time PCR and their correlation was studied by Pearson coefficient and linear regression models. The results obtained by this study showed that TLR4 and COX-2 genes were upregulated and their expression was strongly correlated in peripheral blood of symptomatic patients. Both COX-2 and TLR4 genes are overexpressed only in atherothrombotic stroke. -2604G>A polimorphism is associated with the levels of TLR4 gene expression in peripheral blood. In particular, the presence of allele -2604A in homozygosis resulted in diminished gene expression. Analysis in silico evidenced that allele -2604A creates a putative binding site for GATA-2, a negative transcription regulator. Although these results would need to be confirmed by independent studies, they suggest that the peripheral mechanism of inflammatory injury after atherothrombotic stroke may be mediated by TLR4 through a COX-2-dependent pathway. Furthermore, the specificity of both genes for atherothrombotic stroke indicates that gene expression analysis in peripheral blood might be used as biomarkers for stroke subtype diagnosis. The deregulation of the gene TLR4 may be due by the presence of the polymorphism-2604G>A in atherosclerotic patients. Case/control studies in larger populations are warranted to determine if this variation can represent a risk factor for atherosclerosis.

GENETIC AND EXPRESSION ANALYSIS OF CANDIDATE GENES IN CAROTID PLAQUE AND PERIPHERAL BLOOD OF PATIENTS WITH ATHEROSCLEROSIS

FERRONATO, Silvia
2012

Abstract

L'aterosclerosi, un processo sistemico patologico, è la causa fondamentale della maggior parte degli eventi cardiovascolari, come ictus e infarto del miocardio. L'infiammazione gioca un ruolo centrale nello sviluppo della malattia aterosclerotica, dalle prime fasi di formazione della lesione alla rottura della placca, causa principale delle sindromi acute ischemiche. La prostaglandina E2 (PGE2) è un prostanoide implicato in varie patologie, la cui concentrazione risulta elevata nel processo infiammatorio. La ciclossigenasi (COX) e la prostaglandina E sintasi (PGES) sono gli enzimi responsabili della sintesi di PGE2. In questo lavoro di tesi abbiamo investigato se geni della via COX-2/PGE2 dipendente possono essere differenzialmente espressi nelle placche carotidee e nel sangue periferico di pazienti sintomatici rispetto a pazienti asintomatici. Al fine di valutare se i geni sovraespressi nel sangue periferico di pazienti con ictus siano specificamente associati all’ictus ischemico aterotrombotico, abbiamo analizzato l'espressione di questi geni anche in pazienti con ictus cardioembolico. Abbiamo indagato, inoltre, se polimorfismi specifici nella regione del promotore dei geni up-regolati possano influenzarne l’espressione. Mediante Real Time PCR è stata analizzata l’espressione dei geni COX-2, TLR4, ACE, EP4, EP3, EPRAP e FACL4 e la loro correlazione è stata studiata mediante coefficiente di Pearson e modelli di regressione lineare. Da questo studio è emerso che i geni TLR4 e COX-2 sono sovra espressi nel sangue periferico di pazienti sintomatici e la loro espressione è risultata fortemente correlata. Entrambi i geni sono sovra regolati specificatamente nei pazienti con ictus aterotrombotico. Il polimorfismo -2604G>A è risultato associato ai livelli di espressione del gene TLR4 nel sangue periferico. In particolare, la presenza dell’allele -2604A in omozigosi porta ad una diminuzione dell’espressione genica. Analisi in silico hanno evidenziato che allele -2604A crea un sito di legame putativo per GATA-2, un regolatore negativo della trascrizione. Nonostante questi risultati debbano essere confermati in studi indipendenti, essi suggeriscono che il meccanismo periferico di danno infiammatorio dopo evento ischemico aterotrombotico può essere mediato da TLR4 attraverso una via COX-2-dipendente. Inoltre, la specificità di entrambi i geni per l'ictus di origine aterotrombotico indica che l'analisi della loro espressione genica nel sangue periferico potrebbe essere usata come biomarker per la diagnosi del sottotipo di ictus. La deregolazione del gene TLR4 potrebbe essere influenzata dalla presenza del polimorfismo -2604G>A in pazienti aterosclerotici. Studi caso/controllo in popolazioni più grandi saranno necessari per determinare se questa variazione possa rappresentare un fattore di rischio per l'aterosclerosi.
gene expression; ischemic stroke; polymorphisms; atherosclerosis
Atherosclerosis, a systemic pathological process, is the underlying cause of the majority of clinical cardiovascular events, such as stroke and myocardial infarction. Inflammation plays a central role in the development of atherosclerotic disease, from the early phases of lesion formation to plaque disruption, the main underlying cause of acute ischemic syndromes. Prostaglandin E2 (PGE2) is a prostanoid implicated in a variety of pathologies, whose concentration is elevated in inflammatory process. Cyclooxygenase (COX) and Prostaglandin E Synthase (PGES) are enzymes responsible for PGE2 synthesis. In this work we investigated if genes of COX-2/PGE2 pathway could be differentially expressed in carotid plaques and peripheral blood of symptomatic compared to asymptomatic patients. In order to evaluate if upregulated genes in peripheral blood of stroke patients may be specifically associated to atherothrombotic ischemic stroke, we analyzed expression of these genes also in cardioembolic stroke patients. Moreover, we investigated if specific polymorphisms in the promoter region of the upregulated genes could influence their expression. Expression of COX-2, TLR4, ACE, EP4, EP3, EPRAP and FACL4 genes was analyzed by Real Time PCR and their correlation was studied by Pearson coefficient and linear regression models. The results obtained by this study showed that TLR4 and COX-2 genes were upregulated and their expression was strongly correlated in peripheral blood of symptomatic patients. Both COX-2 and TLR4 genes are overexpressed only in atherothrombotic stroke. -2604G>A polimorphism is associated with the levels of TLR4 gene expression in peripheral blood. In particular, the presence of allele -2604A in homozygosis resulted in diminished gene expression. Analysis in silico evidenced that allele -2604A creates a putative binding site for GATA-2, a negative transcription regulator. Although these results would need to be confirmed by independent studies, they suggest that the peripheral mechanism of inflammatory injury after atherothrombotic stroke may be mediated by TLR4 through a COX-2-dependent pathway. Furthermore, the specificity of both genes for atherothrombotic stroke indicates that gene expression analysis in peripheral blood might be used as biomarkers for stroke subtype diagnosis. The deregulation of the gene TLR4 may be due by the presence of the polymorphism-2604G>A in atherosclerotic patients. Case/control studies in larger populations are warranted to determine if this variation can represent a risk factor for atherosclerosis.
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