Development of a model of humanized mouse to study the cross-talk between tumor and immune system and of a therapeutic approach for pancreatic cancer with human dendritic cells loaded with post-apoptotic tumors

Il cancro al pancreas ha una prognosi scarsa e la percentuale di pazienti affetti da questa patologia che sopravvivono per 5 anni è inferiore all’1%, con una sopravvivenza media che oscilla tra i 4 e i 6 mesi. Ecco perché sono necessarie nuove terapie, e l’immunoterapia potrebbe rivelarsi un approccio terapeutico valido e promettente. Lo sviluppo di un modello preclinico per studiare in vivo l’interazione tra il tumore e il sistema immunitario può essere cruciale. L’obiettivo iniziale di questo studio era la ricostituzione di un sistema immunitario umano in topi immunodeficienti appena nati, mediante un’iniezione intraepatica di cellule staminali ematopoietiche CD34+ derivate dal midollo osseo di pazienti affetti da cancro al pancreas, al fine di ottenere topi umanizzati corrispondenti al paziente, da sottoporre a impianto ortotopico o sottocutaneo di cellule tumorali pancreatiche prelevate dal medesimo paziente. Tale sistema dovrebbe consentire di studiare in vivo l’interazione tra il tumore e il sistema immunitario e di valutare gli approcci immunoterapeutici più validi a seconda del diverso paziente. Sfortunatamente, ad oggi, i problemi burocratici hanno impedito l’acquisizione di cellule precursori CD34+ derivate dal midollo osseo sia di pazienti affetti da cancro al pancreas sia di donatori sani. Per cui abbiamo riprogrammato il lavoro e: 1) abbiamo messo a punto dei protocolli di ricostituzione di un sistema immunitario umano in topi immunodeficienti C57BL/6-Rag2-/-  chain-/- appena nati o adulti, utilizzando cellule mononucleate di sangue periferico di donatori sani (PBMCs) 2) abbiamo sviluppato un modello di ‘trasferimento adottivo cellulare’ (ACT) basato su linfociti T umani attivati in vitro da cellule dendritiche autologhe caricate con cellule necrotiche di adenocarcinoma pancreatico dopo ipertermia o trattamento con UVC. Questi linfociti T attivati in vitro sono stati trasferiti a topi C57BL/6-Rag2-/- chain-/- precedentemente inoculati con la stessa linea cellulare tumorale dal quale sono state derivate le cellule necrotiche usate nella stimolazione in vitro delle cellule dendritiche. Come previsto, la ricostituzione che abbiamo ottenuto usando cellule mononucleate di sangue periferico ha riguardato solo il compartimento delle cellule T e B e non le cellule dell’immunità naturale. Le differenze osservate nei topi ricostituiti mediante iniezione di PBMCs umane alla nascita rispetto ai topi iniettati in età adulta ha riguardato la mortalità e la presenza di cellule T nel sangue periferico. I topi iniettati alla nascita hanno mostrato un’alta mortalità dopo il trattamento (67%) e una percentuale relativamente bassa di animali ricostituiti (45% sul totale degli animali rimasti in vita). Tuttavia i topi ricostituiti da neonati hanno presentato cellule linfoidi umane in circolo nel sangue periferico e negli organi linfoidi. Al contrario, i topi iniettati da adulti con PBMCs di donatori sani hanno mostrato un’ottima sopravvivenza dopo il trattamento, ma la quantità di cellule linfoidi umane in circolo nel sangue periferico si è rivelata molto bassa; tuttavia, la presenza di cellule umane negli organi linfoidi era simile a quella riscontrata nei topi iniettati da neonati. La seconda parte del lavoro presentato si è focalizzata sullo sviluppo di un approccio immunoterapeutico per il cancro al pancreas. Il potenziale immunogenico delle cellule tumorali necrotiche sta ricevendo grande attenzione, in considerazione sia della sua importanza nell’aumento delle cellule T citotossiche specifiche per l’immunoterapia tumorale, sia della sua importanza come migliore fonte di antigeni tumorali (TAA) per le cellule dendritiche (Lake et al., 2005; Nowak et al., 2006). Le cellule dendritiche sono cellule in grado di presentare efficacemente un antigene a linfociti T e, come mostrato di recente, possono essere attivate da molecole DAMPs come l’HMGB-1 e l’HSP-70, che sono altamente espresse sulla superficie di cellule tumorali necrotizzate soprattutto dopo trattamento ipertermico e che inducono l’immunità antitumorale (Shi et al., 2006; Bianchi et al., 2007; Chen et al., 2009). La presentazione antigenica mediante cellule dendritiche è essenziale per ottenere risposte effettive delle cellule antitumorali T in pazienti malati di cancro, ma essa dipende dall’origine, dallo stato di maturazione e dal milieu citochinico. Per questo motivo abbiamo focalizzato la nostra attenzione sull’attivazione di una risposta immunitaria che protegga dal tumore, usando PaCa-44, PT-45, PANC-1 e PANC-2, tutte linee cellulari umane di tumore al pancreas. Abbiamo sviluppato una strategia immunoterapeutica basata su cellule dendritiche umane ottenute dal sangue di donatori sani, caricate con cellule tumorali necrotizzate dopo incubazione a 56°C o esposizione agli UVC. Questo approccio immunoterapeutico pare promettente, soprattutto qualora si ricorra all’esposizione agli UVC come trattamento per necrotizzare il tumore. I trattamenti hanno indotto l’apoptosi seguita da necrosi secondaria delle cellule tumorali e il rilascio nel surnatante di livelli di DAMPs più alti di quelli riscontrati senza trattamenti. Le DAMPs sono responsabili della stimolazione delle cellule dendritiche e, conseguentemente, dell’aumento del potere immunogenico delle cellule tumorali necrotiche, come mostrato dai più alti livelli dei marcatori della maturazione CD80, CD83 e MHC-II espressi dalle cellule dendritiche in presenza delle cellule tumorali necrotiche. La necrosi secondaria ha avuto come risultato anche un miglioramento dell’efficienza di fagocitosi di materiale necrotico da parte delle cellule dendritiche per tutte e quattro le linee cellulari utilizzate. La specifica risposta immunitaria ottenuta quando le cellule T di un donatore sono state aggiunte a cellule dendritiche autologhe attivate in base ai protocolli da noi standardizzati, è cambiata da una linea cellulare all’altra e a seconda del donatore utilizzato. Una risposta immunitaria specifica è stata ottenuta in vitro solo per le linee cellulari PaCa-44 e PT-45, e non contro le linee cellulari PANC-1 e PANC-2. Questi risultati sono stati confermati anche in vivo in un protocollo di immunoterapia curativa usando solo le cellule tumorali PaCa-44 e PT-45, nonostante il numero esiguo di linfociti-T iniettati per singolo animale ed il numero di animali a disposizione per ciascun gruppo sperimentale siano stati e restino tuttora un punto cruciale nello sviluppo del modello preclinico.

Pancreatic cancer has a poor prognosis and the 5-years survival rate is less than 1%, with a median survival of 4–6 months. For this reason, new therapies are needed and immunotherapy might be an option. The development of a preclinical model to study in vivo the cross-talk between tumor and immune system can be crucial. The initial aim of this study was the reconstitution of newborn immunodeficient mice with intrahepatically injection of bone marrow-derived leukocyte precursor CD34+ cells from pancreatic cancer patients, in order to obtain patient-specific humanized mice, to be implanted subcutaneously or orthotopically with pancreatic tumor cells from the same patient; such a system should allow to study in vivo the cross-talk between tumor and immune system and to evaluate immunotherapeutic approaches in a “patient-specific setting“. Unfortunately, burocratic problems hampered so far the acquisition of bone marrow-derived leukocyte precursor CD34+ cells from pancreatic cancer patients as well as from healthy donors. Therefore, we reprogrammed the the study and: 1- we established protocols of delivery of human PBMCs to C57BL/6-Rag2-/-  chain-/- immunodeficient mice, starting from either newborn or adult mice; 2- we developed an adoptive cell transfer (ACT) therapy based on human T lymphocytes activated in vitro by autologous DCs loaded with necrotic pancreatic tumor cells after hyperthermia or UVC treatment, to be delivered to C57BL/6-Rag2-/-  chain-/- mice bearing the same human pancreatic tumor from which the necrotic cells used for DC loading were derived. As expected, the reconstitution we obtained using human PBMCs regarded only the human T and B cells compartment, and not cells of the innate immunity. The differences observed in mice reconstituted by injection of human PBMCs at newborn versus mice injected at adult age concerned mortality and the presence of T cells in peripheral blood. Mice injected at newborn age showed very high mortality following injection (67%) and relatively low percentage of reconstituted animals (45% of alive animals). Nevertheless reconstituted mice presented human lymphoid cells either circulating in the blood or in lymphoid organs. On the contrary, mice injected with human PBMCs at adult age did not show any mortality effect, but the amounts of circulating human lymphoid cells in the blood was very low, even if engrafment of human cells in lymphoid organs was similar to that found in mice injected at newborn and adult age. The second part of work presented is focused on the development of an immunotherapeutic approach for pancreatic cancer. The immunogenic potential of dying tumor cells is receiving great attention on account of both its importance in enhancing T-cell directed immunotherapy and its indication of the best immunogenic source for ex vivo TAA DCs loading (Lake et al., 2005; Nowak et al., 2006). DCs are potent antigen-presenting cells and, as recently shown, can be activated by DAMPs, such as HMGB-1 and HSP-70, that are highly expressed after hyperthermia treatment of cancer cells and that induce anti-tumor immunity (Shi et al., 2006; Bianchi et al., 2007; Chen et al., 2009). Antigen presentation by DCs is essential to effective antitumor T cells responses in cancer patients, but it depends on DCs origin, maturation state and the environmental cytokine milieu. For this reason, we focused our attention on the activation of a tumor-protective immune response using human PaCa-44, PT-45, PANC-1 and PANC-2 pancreatic tumor cell lines. We developed an immunotherapeutic strategy based on human dendritic cells from healthy blood donors loaded with cancer cells in secondary necrosis due to incubation at 56°C or exposure to UVC. This immunotherapeutic approach appears promising, especially using UVC exposure as tumor death treatment. The treatments induced apoptosis followed by secondary necrosis and the release in the supernatant of levels of DAMPs much higher than without treatment. DAMPs are responsible for stimulation of DCs to antigen uptake and maturation, and consequently, for an increased immunogenity of tumor cells, as shown by the expression of higher levels of maturation markers such as CD80, CD83 and MHC-II. Secondary necrosis also resulted in an improvement of uptake efficiency by DCs for all the four different pancreatic cancer cell lines. The specific immune response obtained when T cells from the same donor as DCs were added to activated DCs according to standard protocols, was variable between different pancreatic cancer cell lines and it was also blood donor-dependent: a specific immune response was obtained in vitro only against PaCa-44 and PT-45 cancer cell lines, and not against PANC-1 and PANC-2 cell lines. These results were also confirmed in vivo in a protocol of curative immunotherapy using PaCa-44 and PT-45 cancer cells only, even if the low number of T-lymphocytes injected and of animals for each groups are a crucial points for the assessment of a functional preclinical model.