L'uva contiene un vasto assortimento di metaboliti primari e secondari, che sono importanti sia per la qualità e le proprietà sensoriali del vino che per l'effetto positivo sulla salute umana.La tesi è dedicata allo studio del metaboloma della bacca d'uva attraverso LC-MS, GC-MS e analisi di dati multivariata. Il capitolo 1 è un'introduzione sulla metabolomica dell'uva. La prima parte è dedicata all'importanza dei metaboliti dell'uva mentre la seconda riguarda le diverse piattaforme tecnologiche utilizzate nel campo della metabolomica dell'uva e le analisi di dati multivariata, in particolare con metodo OPLS/O2PLS.Nella terza parte sono riportati alcuni trend recenti nel campo della metabolomica. Il capitolo 2 è dedicato allp sviluppo di nuovi approcci metodologici per studiare il terroir,ovvero l'effetto dell'ambiente e pratiche viticolturali sulla qualità dell'uva. I metaboliti secondari e quelli volatili sono stati analizzati in bacche della varietà Corvina raccolti in 3 annate in 11 vigneti nell'area di Verona. Sono stati proposti due diversi approcci. Un'analisi preliminare unsupervised ha evidenziato il forte effetto del clima sul metaboloma di Corvina. L'approccio più corretto è risultato quindi essere l'analisi delle tre annate contemporaneamente. In seguito, diversi modelli multivariata sono stati costruiti e validati per evitare problemi di overfitting. Alcuni modelli, oltre a quello delle annate, sono risultati essere validi e hanno dato informazioni in termini di metaboliti. In particolare, due vigneti localizzati nell'area del Lago di Garda e caratterizzati da suoli franchi, sono risultati essere ricchi di metaboliti volatili della classe dei benzeni rispetto agli altri vigneti. E' stato poi proposto un secondo approccio di tipo unsupervised in cui è stata ridotta la variabilità nel metaboloma di bacche dovuta al clima, per studiare il terroir come il set di metaboliti che non mostra variabilità dovuta all'annata. L'analisi del dataset di LC-MS ha mostrato che specifici livelli di metaboliti secondari caratterizza in modo diverso i vigneti. Dall'analisi della matrice di GC-MS due cluster di produttori sono stati evidenziati ma nessuna caratteristica dei vigneti analizzata nel lavoro è in grado di spiegare il raggruppamento. Specifiche caratteristiche del terroir influenzano quindi il metaboloma di Corvina, ma queste catatteristiche sono correlate a sottili variazioni di un vasto numero di metaboliti più che da poche e importanti variazioni di pochi metaboliti. Il terzo capitolo è dedicato allo studio delle risposte metaboliche di sei differenti varietà d'uva (Cabernet Sauvignon, Corvina,Merlot,Oseleta, Sangiovese e Shiraz) durante il processo di appassimento in fruttai. Un primo approccio è basato sull'analisi dei dati crudi e ha permesso di discriminare le sei varietà in base al loro metaboloma. Un secondo approccio è basato sull'analisi dei dati normalizzati per il calo ponderale in modo da compensare l'effetto di concentrazione dovuto alla perdita d'acqua. La modulazione di antocianine, flavonoids, flavan-3-oli e procianidine, acidi idrossibenzoici e idrossicinnamici sono dovute principalmente all'effetto di concentrazione e alla degradazione. I composti appartenenti alla classe di stilbeni e viniferine sono risultati essere ampiamente indotti durante il processo di appassimento in tutte le varietà eccetto Cabernet Sauvignon; tali metaboliti potrebbero avere un ruolo nella difesa durante le condizioni di stress dell'appassimento. L'ultima parte del capitolo è dedicata all'analisi della modulazione dei metaboliti volatili delle varietà Corvina e Shiraz. I sesquterpeni, una classe di molecole terpeniche, sono ampiamente indotti in Corvina durante l'appassimento e potrebbero avere un ruolo nel signalling cellulare e nella risposta agli stress.

Grape vine is one of the most important fruit crop in the world. Numerous grape varieties are grown worldwide for production of wine or food. Grape berries contain a large and diverse range of primary and secondary metabolites, that are important for wine quality and sensory attributes but also for their positive impact on human health. This thesis is dedicated to the study of grape metabolomes through LC-MS, GC-MS and advanced multivariate data analysis. This thesis is divided into three main chapters, covering different aspects of grape metabolomics. Chapter 1 is a review on grape metabolomics. The first part is dedicated to the importance of grape and its metabolites, with particular regards on the effect on wine sensory properties. The second part covers the different analytical platforms used in grape metabolomics and the importance of multivariate data analysis, particularly with newly developed OPLS/O2PLS. In the third part, some recent trends in grape metabolomics are described. Chapter 2 is dedicated to the development of new methodological approaches to study terroir, or the effect of environmental and viticultural features on grape and wine quality. Secondary non-volatile and volatile metabolites were extracted from berries of cv. Corvina harvested in three vintages (2006, 2007 and 2008) in eleven vineyards located in the area surrounding Verona. Two different approaches were proposed, based on multivariate data analysis. First, a preliminary unsupervised analysis allowed highlighting the strong effect of climate on cv. Corvina metabolome. The most correct approach resulted to be the analysis of the three vintages together. Several multivariate models were built using vineyard features and validated to avoid over fitting. Few models, beside the one of vintages, gave information in terms of metabolites. Particularly, two vineyards located in Lake Garda area and with by loam soils were characterized by high contents of benzene derivative volatiles compared to other vineyards. A second and completely unsupervised approach was used to reduce the variability in the metabolome that was due to climate, so that to study terroir as the set of metabolites that did not show a year-dependent variation. The analysis of LC-MS dataset revealed that each single vineyard was characterized by specific levels of secondary metabolites. When analysing the GC-MS matrix, two clusters of producers where obtained but no single feature of terroir considered in this survey could explain the grouping. Specific terroir features were suggested to affect the metabolome composition, but such features were mainly correlated to very subtle variation of large sets of metabolites rather than to sharp variation of few metabolites. Chapter 3 is dedicated to the study of the metabolic responses of six different grape varieties (Cabernet Sauvignon, Corvina, Merlot, Oseleta, Sangiovese and Shiraz) during postharvest withering process. A first approach was based on the analysis of raw data and allowed the discrimination of the six varieties by their metabolomes. The second approach was based on the analysis of data matrix normalized for the weight loss, to compensate the concentration effect due to water loss. Modulation of anthocyanin, flavonoid, flavan-3-ol and procyanidin, hydroxybenzoic and hydroxycinnamic acid classes were mainly due to concentration effect and degradation. Compounds belonging to class of stilbenes and viniferins were highly induced during postharvest withering in all the varieties but Cabernet Sauvignon and might act as defence mechanism during stress conditions. The last part of Chapter 3 is focused on the different modulation of volatile compounds in Corvina and Shiraz varieties. Sesquiterpenes, a class of terpene molecules, were highly induced in Corvina during withering and may have a role in stress response and signalling.

Mass spectrometry techniques and chemometric approaches for the study of grape metabolome

ANESI, Andrea
2012

Abstract

L'uva contiene un vasto assortimento di metaboliti primari e secondari, che sono importanti sia per la qualità e le proprietà sensoriali del vino che per l'effetto positivo sulla salute umana.La tesi è dedicata allo studio del metaboloma della bacca d'uva attraverso LC-MS, GC-MS e analisi di dati multivariata. Il capitolo 1 è un'introduzione sulla metabolomica dell'uva. La prima parte è dedicata all'importanza dei metaboliti dell'uva mentre la seconda riguarda le diverse piattaforme tecnologiche utilizzate nel campo della metabolomica dell'uva e le analisi di dati multivariata, in particolare con metodo OPLS/O2PLS.Nella terza parte sono riportati alcuni trend recenti nel campo della metabolomica. Il capitolo 2 è dedicato allp sviluppo di nuovi approcci metodologici per studiare il terroir,ovvero l'effetto dell'ambiente e pratiche viticolturali sulla qualità dell'uva. I metaboliti secondari e quelli volatili sono stati analizzati in bacche della varietà Corvina raccolti in 3 annate in 11 vigneti nell'area di Verona. Sono stati proposti due diversi approcci. Un'analisi preliminare unsupervised ha evidenziato il forte effetto del clima sul metaboloma di Corvina. L'approccio più corretto è risultato quindi essere l'analisi delle tre annate contemporaneamente. In seguito, diversi modelli multivariata sono stati costruiti e validati per evitare problemi di overfitting. Alcuni modelli, oltre a quello delle annate, sono risultati essere validi e hanno dato informazioni in termini di metaboliti. In particolare, due vigneti localizzati nell'area del Lago di Garda e caratterizzati da suoli franchi, sono risultati essere ricchi di metaboliti volatili della classe dei benzeni rispetto agli altri vigneti. E' stato poi proposto un secondo approccio di tipo unsupervised in cui è stata ridotta la variabilità nel metaboloma di bacche dovuta al clima, per studiare il terroir come il set di metaboliti che non mostra variabilità dovuta all'annata. L'analisi del dataset di LC-MS ha mostrato che specifici livelli di metaboliti secondari caratterizza in modo diverso i vigneti. Dall'analisi della matrice di GC-MS due cluster di produttori sono stati evidenziati ma nessuna caratteristica dei vigneti analizzata nel lavoro è in grado di spiegare il raggruppamento. Specifiche caratteristiche del terroir influenzano quindi il metaboloma di Corvina, ma queste catatteristiche sono correlate a sottili variazioni di un vasto numero di metaboliti più che da poche e importanti variazioni di pochi metaboliti. Il terzo capitolo è dedicato allo studio delle risposte metaboliche di sei differenti varietà d'uva (Cabernet Sauvignon, Corvina,Merlot,Oseleta, Sangiovese e Shiraz) durante il processo di appassimento in fruttai. Un primo approccio è basato sull'analisi dei dati crudi e ha permesso di discriminare le sei varietà in base al loro metaboloma. Un secondo approccio è basato sull'analisi dei dati normalizzati per il calo ponderale in modo da compensare l'effetto di concentrazione dovuto alla perdita d'acqua. La modulazione di antocianine, flavonoids, flavan-3-oli e procianidine, acidi idrossibenzoici e idrossicinnamici sono dovute principalmente all'effetto di concentrazione e alla degradazione. I composti appartenenti alla classe di stilbeni e viniferine sono risultati essere ampiamente indotti durante il processo di appassimento in tutte le varietà eccetto Cabernet Sauvignon; tali metaboliti potrebbero avere un ruolo nella difesa durante le condizioni di stress dell'appassimento. L'ultima parte del capitolo è dedicata all'analisi della modulazione dei metaboliti volatili delle varietà Corvina e Shiraz. I sesquterpeni, una classe di molecole terpeniche, sono ampiamente indotti in Corvina durante l'appassimento e potrebbero avere un ruolo nel signalling cellulare e nella risposta agli stress.
metabolomica; analisi di dati multivariata; metaboliti secondari; LC-MS; metaboliti volatili; GC-MS; uva; terroir; appassimento
Grape vine is one of the most important fruit crop in the world. Numerous grape varieties are grown worldwide for production of wine or food. Grape berries contain a large and diverse range of primary and secondary metabolites, that are important for wine quality and sensory attributes but also for their positive impact on human health. This thesis is dedicated to the study of grape metabolomes through LC-MS, GC-MS and advanced multivariate data analysis. This thesis is divided into three main chapters, covering different aspects of grape metabolomics. Chapter 1 is a review on grape metabolomics. The first part is dedicated to the importance of grape and its metabolites, with particular regards on the effect on wine sensory properties. The second part covers the different analytical platforms used in grape metabolomics and the importance of multivariate data analysis, particularly with newly developed OPLS/O2PLS. In the third part, some recent trends in grape metabolomics are described. Chapter 2 is dedicated to the development of new methodological approaches to study terroir, or the effect of environmental and viticultural features on grape and wine quality. Secondary non-volatile and volatile metabolites were extracted from berries of cv. Corvina harvested in three vintages (2006, 2007 and 2008) in eleven vineyards located in the area surrounding Verona. Two different approaches were proposed, based on multivariate data analysis. First, a preliminary unsupervised analysis allowed highlighting the strong effect of climate on cv. Corvina metabolome. The most correct approach resulted to be the analysis of the three vintages together. Several multivariate models were built using vineyard features and validated to avoid over fitting. Few models, beside the one of vintages, gave information in terms of metabolites. Particularly, two vineyards located in Lake Garda area and with by loam soils were characterized by high contents of benzene derivative volatiles compared to other vineyards. A second and completely unsupervised approach was used to reduce the variability in the metabolome that was due to climate, so that to study terroir as the set of metabolites that did not show a year-dependent variation. The analysis of LC-MS dataset revealed that each single vineyard was characterized by specific levels of secondary metabolites. When analysing the GC-MS matrix, two clusters of producers where obtained but no single feature of terroir considered in this survey could explain the grouping. Specific terroir features were suggested to affect the metabolome composition, but such features were mainly correlated to very subtle variation of large sets of metabolites rather than to sharp variation of few metabolites. Chapter 3 is dedicated to the study of the metabolic responses of six different grape varieties (Cabernet Sauvignon, Corvina, Merlot, Oseleta, Sangiovese and Shiraz) during postharvest withering process. A first approach was based on the analysis of raw data and allowed the discrimination of the six varieties by their metabolomes. The second approach was based on the analysis of data matrix normalized for the weight loss, to compensate the concentration effect due to water loss. Modulation of anthocyanin, flavonoid, flavan-3-ol and procyanidin, hydroxybenzoic and hydroxycinnamic acid classes were mainly due to concentration effect and degradation. Compounds belonging to class of stilbenes and viniferins were highly induced during postharvest withering in all the varieties but Cabernet Sauvignon and might act as defence mechanism during stress conditions. The last part of Chapter 3 is focused on the different modulation of volatile compounds in Corvina and Shiraz varieties. Sesquiterpenes, a class of terpene molecules, were highly induced in Corvina during withering and may have a role in stress response and signalling.
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