Nuove tecniche di separazione in fase liquida (micro-HPLC ed Elettroforesi Capillare) accoppiate alla spettrometria di massa: applicazioni tossicologiche e biomediche

Nell’ultimo decennio tecniche analitiche come l’elettroforesi capillare (CE) e la micro-HPLC hanno assunto sempre maggiore interesse, in particolare nei settori dove l’analita è presente in tracce nel campione, come nell’analisi tossicologico-forense, nell’analisi alimentare, nella chimica combinatoriale e nel drug discovery. In particolare in ambito forense per molti anni la gas-cromatografia è stata la tecnica di elezione, soprattutto per la robustezza analitica e l’alta sensibilità. Questa tecnica è particolarmente adatta all’analisi rapida di miscele di sostanze volatili,ma presenta tuttavia alcuni svantaggi tra cui l’impossibilità di analizzare sostanze non volatili e termolabili, e la necessità di derivatizzazione nella determinazione di molte droghe e dei loro metaboliti. Questo se da un lato non ha limitato la diffusione di questa tecnica, dall’altro ha orientato l’interesse verso tecniche cromatografiche in fase liquida, principalmente l’HPLC. La cromatografia liquida ad alte prestazioni si è subito imposta in tutti i settori analitici, principalmente perché consente l’utilizzo di rivelatori basati su principi chimico-fisici diversi il che la rende estremamente versatile. Questa tecnica viene utilizzata di routine per testare prodotti di impiego in campo farmaceutico, per applicazioni biomediche e biochimiche, nonché per il controllo qualità. Più recentemente sono state sviluppate numerose geometrie di interfacciamento di questa tecnica con un rivelatore altamente sensibile quale lo spettrometro di massa. Il notevole incremento di sensibilità e selettività così ottenuto spiega la vasta diffusione della strumentazione LC-MS nei laboratori di chimica analitica particolarmente nel settore farmaceutico, ambientale e alimentare, dove essendo gli analiti altamente polari, la gas-cromatografia non è applicabile se non previa derivatizzazione. Solo più recentemente questa tecnica si è diffusa anche nell’analisi forense, costituendo una valida alternativa alla gas-cromatografia. L’elettroforesi capillare (CE) è una tecnica analitica più recente che, originatasi dall’ottimizzazione strumentale delle tradizionali tecniche elettroforetiche, è diventata una tecnologia indipendente con applicazioni nelle più diverse discipline chimico-analitiche. La CE si propone con alcune caratteristiche del tutto peculiari e di estremo interesse per le discipline analitiche sia farmaceutiche che forensi, quali grande versatilità di applicazione (ioni organici e inorganici, droghe, farmaci, composti chirali ma anche macromolecole), elevata sensibilità in termini di massa, possibilità di applicazione secondo differenti modalità separative impiegando diversi sistemi di rivelazione, bassi costi di gestione e robustezza sperimentale. Solo più recentemente su modello delle interfacce disponibili per LC-MS è stato realizzato l’interfacciamento CE-MS, unendo l’elevata efficienza separativa che caratterizza la CE con l’alta sensibilità e selettività portate dal rivelatore di massa. In ambito forense questa moderna tecnica non ha ancora avuto grande diffusione ma sembra già dare promettenti risultati benchè le geometrie di interfacciamento disponibili non siano ancora ottimizzate. Lo scopo del presente lavoro è stato quello di esplorare le possibilità offerte da queste nuove metodiche di separazione in fase liquida (micro-HPLC e CE) al fine di mettere a punto nuovi metodi per la separazione di molecole di interesse medico-legale e biomedico.

In the last decade, analytical techniques such as capillary electrophoresis (CE) and micro-HPLC have grown in interest, particularly in the areas where the analyte is present in traces in the sample, such as forensic toxicological analysis, food analysis, combinatorial chemistry and drug discovery. In particular, in the forensic field for many years gas chromatography has been the technique of choice, specifically for the robustness and high analytical sensitivity. This technique is particularly suitable for the rapid analysis of mixtures of volatile substances, but nevertheless is not suitable for highly polar, non volatile and thermally unstable substances, as many of the target drugs of forensic interest are. In most instances, these drawbacks can be overcome by introducing a derivatisation step, this however creates a new source of variability and complexity. High performance liquid chromatography (HPLC) was immediately utilized in all analytical areas, principally because it allows the use of detectors based on different physical-chemical principles which makes it extremely versatile. This technique is routinely used in the pharmaceutical field, in biochemical and biomedical applications, as well as for quality control. More recently the possibility to hyphenate HPLC with the mass spectrometer, significantly increased the sensitivity and selectivity obtained thus explaining the wide spread of LC-MS instrumentation in analytical chemistry laboratories particularly in the pharmaceutical, environmental, and food analysis fields. Only more recently, this technique has spread to forensic analysis, providing a viable alternative to gas chromatography. In recent years, capillary electrophoresis (CE) has been introduced as a new independent separation technique, showing original characteristics in terms of separation mechanisms, speed of analysis, separation efficiency and minimal sample requirements. The hyphenation of CE with MS has been successfully applied in many fields of analytical chemistry and biochemistry combining the high separative efficiency that characterizes the CE with high sensitivity and selectivity brought by the mass detector. Although the geometry of the interfaces are not yet optimized, CE-MS seems to give promising results. The purpose of this study was to explore the possibilities offered by these new liquid phase separation techniques (micro-HPLC and CE) in order to develop new methods for the separation of molecules of forensic and biomedical interest.