The three-dimensional crystal structure of carp fish egg lectin

Una nuova lectina è stata recentemente scoperta ed isolata nel nostro laboratorio dalle uova di carpa ed è stata denominata Fish Egg Lectin (FEL). FEL è una glicoproteina di 238 aminoacidi dal peso molecolare di 26.6 kD e l’analisi della sequenza ha mostrato una certa omologia con una lectina isolata dal plasma del granchio Tachypleus tridentatus, la Tachylectin 1, che è coinvolta nella risposta immunitaria aspecifica di questo invertebrato. Studi biochimici eseguiti dal gruppo della Prof. Galliano (Università di Pavia) hanno evidenziato che questa lectina è monomerica in soluzione e che è in grado di legare i carboidrati presenti sulla parete di cellule batteriche sia Gram positive che negative. Tra i monosaccaridi, la più alta affinità è stata riscontrata verso la N-acetilglucosamina e la N-acetilgalattosamina mentre sembra essere molto bassa o nulla nei confronti dei corrispondenti carboidrati non acetilati e verso i disaccaridi come il lattosio. Saggi immunoistochimici hanno dimostrato inoltre che la FEL è una proteina specifica delle uova ed è assente in tutti gli altri tessuti. Nonostante ciò è la prima volta che una lectina di questo tipo viene descritta in un animale vertebrato (può essere considerata come la prima di una nuova famiglia) e il suo reale ruolo fisiologico risulta ancora da chiarire. l lavoro di questa tesi si è focalizzato sullo studio strutturale della Fish Egg Lectin di carpa mediante diffrazione di raggi X. Numerose prove di cristallizzazione sono state preparate con la proteina nativa fino ad ottenere cristalli singoli adatti agli studi di diffrazione. I cristalli migliori sono stati ottenuti con la tecnica della diffusione di vapore utilizzando una miscela di 15% 2-propanolo, 20% PEG 6000, 0.1 M HEPES pH 7.5 come precipitante. Dall’analisi dei dati di diffrazione si è potuto stabilire che tali cristalli sono ortorombici e che appartengono al gruppo spaziale P212121, con parametri di cella a = 44.72 Å, b = 72.28 Å e c = 167.59 Å. Non essendo possibile risolvere il problema della fase per sostituzione molecolare (non è stata risolta finora nessuna struttura di proteine ritenute omologhe alla FEL), si è dovuto procedere con il metodo classico della sostituzione isomorfa multipla. Numerosi derivati sono stati preparati facendo reagire i cristalli della proteina con vari composti di atomi pesanti ed i dati di diffrazione sono stati raccolti ed analizzati. Fra questi, i migliori tre (quelli ottenuti con K2PtCl4, Hg(Ac)2 e UO2(Ac)2) sono stati utilizzati per il calcolo delle fasi dei fattori di struttura. Sono quindi state calcolate le mappe di densità elettronica a 2.5 Å di risoluzione ed il modello molecolare è stato costruito e raffinato. Nell’unità asimmetrica questa lectina si presenta come un omodimero in cui ciascun monomero è un dominio “six β-propeller”, una struttura simmetrica costituita in prevalenza da β-strands antiparalleli che nel suo insieme ricorda un’elica con sei pale con un canale centrale. L’analisi dei contatti intermolecolari ed i calcoli sulla superficie di contatto fra i monomeri inducono a supporre che la formazione del dimero non sia dovuta semplicemente all’impacchettamento nel cristallo ma che questa abbia invece un significato funzionale (in contrasto con i risultati pubblicati in precedenza). Un sito di legame per lo ione calcio è presente nella cavità centrale di ogni monomero . Allo scopo di identificare i siti di legame per i carboidrati, alcuni cristalli della proteina nativa sono stati immersi in una soluzione del liquido cristallizzante contenente 0.1 M N-acetilglucosamina ed i dati di diffrazione raccolti ed analizzati. Un singolo sito di legame è stato identificato con certezza su uno solo dei due monomeri, in contrasto con la presenza di siti multipli descritta in altre due lectine con struttura a β-propeller. L’evidenza di un unico sito (per di più in un omodimero) è con maggior probabilità dovuta al metodo utilizzato per la preparazione dei cristalli del complesso o alla bassa affinità per il ligando utilizzato piuttosto che ad una reale peculiarità di questa proteina. La modalità di legame della N- acetilglucosamina ricorda quella descritta per un’altra lectina di Tachypleus tridentatus, Tachylectin 5A, in cui il gruppo acetile è alloggiato all’interno di una cavità idrofobica sulla superficie della proteina mentre il resto della molecola risulta esposto al solvente. Altre due forme cristalline della proteina nativa, un’altra ortorombica ed una trigonale, sono state ottenute e risolte con il metodo della sostituzione molecolare utilizzando le coordinate di un monomero. La seconda forma cristallina ortorombica cresce nelle stesse condizioni della prima ed è molto probabilmente il risultato di un riarrangiamento dell’impacchettamento cristallino di quest’ultima: l’unità asimmetrica è infatti praticamente identica e la cella unitaria differisce solo per la minore lunghezza dell’asse c. La terza forma cristallina, invece, appartiene al gruppo spaziale trigonale P3 ed è stata ottenuta con una diversa soluzione cristallizzante. L’unità asimmetrica è un esamero formato da tre dimeri. L’analisi dei contatti intermolecolari e dell’ orientazione dei monomeri in ciascun dimero dimostra che ciascuno di questi è molto simile a quelli che costituiscono l’unità asimmetrica delle forme cristalline ortorombiche. La presenza della medesima unità strutturale in diverse forme cristalline è stata interpretata come un’ ulteriore prova a favore della natura dimerica di questa lectina.

A novel lectin present in carp eggs was recently discovered and characterized in our laboratory and named Fish Egg Lectin (FEL). FEL is a glycoprotein of 238 amino acids with a molecular weight of 26.6 kD. The sequence analysis showed a significant similarity with a lectin present in the plasma and haemocytes of the horseshoe crab Tachypleus tridentatus, Tachylectin 1, involved in the non specific immune response of the invertebrate. Biochemical studies performed by the research group of Prof. Galliano (University of Pavia) have evidenced that this lectin is present in solution as a monomer and can bind to saccharides on the surfaces of Gram positive and negative bacteria. N- acetylglucosamine and N-acetylgalactosamine show the highest affinity among the monosaccharides while the lectin has little or no affinity for simple sugars or disaccharides as lactose. Immunohistochemical studies demonstrated that FEL is an egg specific protein and that it is absent from every other tissue in fish. It is the first time that a lectin like this is described in a vertebrate and its real biological role has still to be understood. This thesis focuses on the three-dimensional structure study of FEL by X- ray diffraction analysis of single crystals. After numerous trials, diffraction quality crystals of the native protein were prepared using a solution of 15% 2-propanol, 20% PEG 6000, 0.1 M HEPES pH 7.5 as precipitant. They are orthorhombic and belong to the space group P212121, with cell parameters a = 44.72 Å, b = 72.28 Å and c = 167.59 Å. The phase problem was solved by the multiple isomorphous replacement method. Several derivatives were prepared by soaking protein crystals in mother liquor containing the heavy atom compound and the diffraction data were collected and analysed. The best three derivatives (K2PtCl4, Hg(Ac)2 and UO2(Ac)2) were used in the phase determination process. 2.5 Å resolution electron density maps were calculated and the molecular model was built and refined. In the asymmetric unit this lectin is present as a homodimer in which both monomers have a six β-propeller fold, a highly symmetric structure made up six “blades” of antiparallel β-strands that surround a central cavity. The analysis of intermolecular contacts and the change in accessible surface area upon dimer formation indicate that the dimeric form of FEL is the real physiological unit and not an artefact of crystal packing. A calcium-binding site was identified and described in the central tunnel of each monomer. The binding of monosaccharides was investigated by soaking FEL crystals in mother liquor containing 0.1 M N-acetylglucosamine and collecting the diffraction data of the complex. Only one GlcNAc binding site was identified in one of the monomers, in contrast with the presence of multiple binding sites described for other β-propeller lectins. The evidence of a single site, especially in a homodimer, is more likely due to the method used for complex preparation or to the low affinity for the ligand rather than to a real peculiarity of this protein. The binding of GlcNAc resembles that described for another lectin of Tachypleus tridentatus, Tachylectin 5A, with the acetyl group located in a hydrophobic cavity of the molecular surface and the glycosidic ring exposed to the solvent. Two other crystal forms were obtained and solved by molecular replacement with the coordinates of a monomer as search probe. A second orthorhombic form grows more slowly in the same conditions of the first one and it can be considered the result of a rearrangement of the crystal packing: the asymmetric unit is basically identical in the two forms and the unit cell differs only for the shorter length of the c axis. The third crystal form is trigonal and belongs to the space group P3. It was obtained under different crystallization conditions and the asymmetric unit is a hexamer arranged as a trimer of dimers. The analysis of the intermolecular contacts and the orientation of the monomers in each dimer revealed that they are very similar to each other and to those that make up the asymmetric unit of the orthorhombic forms. The presence of the same structural unit in three different crystal forms reinforces the assumption of the physiological dimeric nature of this lectin.