DEVELOPMENT and APPLICATIONS of NOVEL BIOTECHNOLOGICAL TOOLS to INVESTIGATE the PHYSIOPATHOLOGICAL ROLE of RECEPTOR-TYPE TYROSINE PROTEIN PHOSPHATASE GAMMA (PTPRG)

Background: Le Protein-Tirosin Fosfatasi (PTPs) costituiscono una nuova classe di molecole segnale implicate nello sviluppo, nella regolazione della proliferazione, nella migrazione e trasformazione cellulare. Inoltre, il non corretto funzionamento di molte PTPs contribuiscono all’eziopatogenesi di diverse patologie nell’ambito umano. Per tale motivo negli ultimi anni numerose ricerche si sono incentrate proprio su questa famiglia di proteine e alcune di esse ora sono in fase di valutazione come potenziali bersagli farmacologici. In considerazione di queste premesse, il nostro studio si è focalizzato su PTPRG (Protein- Tirosin Fosfatasi Recettoriale Gamma) un membro delle Tirosin Fosfatasi “classiche”. E’ noto che PTPRG regoli la differenziazione ematopoietica in un modello di cellule staminali embrionali murine e che sia coinvolta come possibile gene oncosopressore nel cancro del rene, del polmone, del colon, dell’ovaio e del seno. Le nostre ricerche, grazie anche all’ausilio di nuovi strumenti che abbiamo creato e messo a punto per lo studio di questa proteina, ci hanno permesso di proporre un importante ruolo di PTPRG in condizioni sia fisiologiche che patologiche. Obiettivi: 1) mettere a punto o creare nuovi strumenti per lo studio di PTPRG; 2) studiare l'espressione di PTPRG in tessuti normali; 3) studiare l'espressione di PTPRG in tessuti neoplastici; 4) effettuare studi funzionali sul ruolo di PTPRG nelle neoplasie. Metodi : Purificazione di cellule ematopoietiche e loro coltura, citofluorimetria, tecniche di immunofluorescenza e immunoistochimica, PCR, real-time PCR e Western Blot. Risultati: Obiettivo 1: Abbiamo messo a punto saggi di PCR quantitativa e semi-quantitativa, creato un nuovo anticorpo per lo studio di PTPRG in citofluorimetria, messo a punto le condizioni per tre anticorpi che riconoscono la proteina PTPRG in diversi domini nell’ambito di studi di immunoistochimica di tessuti in paraffina. Obiettivo 2: Espressione nei tessuti normali: a) PTPRG è un nuovo marcatore di cellule dendritiche e macrofagi specializzati e viene espressa ad elevati livelli da b) precursori circolanti CD34+ ; c) cellule endocrine, d) cellule endoteliali ed epiteliali. e) Abbiamo raccolto evidenze sperimentali che dimostrano il rilascio della porzione extracellulare in forma solubile. Obiettivo 3: PTPRG e neoplasie: a) abbiamo descritto una sostanziale diminuzione dell'espressione della proteina nei tumore dell'ovaio (21%), della mammella (56%) e del polmone (80%), mentre una positività citoplasmatica è stata riscontrata nel 37% dei linfomi, soprattutto quelli ad alto grado di malignità. Inoltre, PTPRG viene sovraespressa nella maggior parte degli astrocitomi ad alto grado, mentre la proteina è normalmente presente soltanto in pochi elementi neuronali e gliali. b) l’espressione di PTPRG viene notevolmente e selettivamente ridotta pazienti affetti da leucemia mieloide cronica (CML) sia a livello di sangue periferico, sia nel midollo osseo, fenomeno che coinvolge anche le cellule CD34+ e viene ristabilita nei casi di remissione molecolare della malattia. Obiettivo 4: Studi funzionali: a) PTPRG nella CML: l’espressione di PTPRG è ridotta o assente nelle linee cellulari di leucemia mieloide cronica, ove la ridotta espressione correla con livelli più alti di clonogenicità e di proliferazione, mentre la sovra-espressione inibisce entrambi i parametri. Mentre l’espressione di una forma mutata inattiva di PTPRG non altera la clonogenicità, la proliferazione è parzialmente inibita da essa; b) l’espressione di PTPRG è ridotta durante la differenziazione ematopoietica delle cellule CD34+; c) l’espressione di PTPRG correla con un fenotipo tolerogenico in cellule denritiche differenziate in vitro da soggetti umani. Conclusioni: Sulla base di tali osservazioni possiamo proporre PTPRG come un nuovo marcatore regolato funzionalmente nei leucociti il cui preciso ruolo in contesti fisiologici e patologici necessita di ulteriori approfondimenti. Abbiamo descritto come i livelli d'espressione di PTPRG siano particolarmente elevati nelle cellule endocrine e come varino significativamente nel contesto di determinate neoplasie, probabilmente riflettendo lo stato indifferenziato delle cellule neoplastiche e suggerendo un complesso ruolo di questa fosfatasi. Questi risultati indicano PTPRG come un possibile bersaglio farmacologico, la cui ridotta espressione rappresenta un evento critico coinvolto nella patogenesi della leucemia mieloide cronica. La sua misurazione potrebbe trovare applicazioni cliniche nella conferma della diagnosi e durante il “follow up” della malattia.

Background: Protein tyrosine phosphatases (PTPs) have emerged as a new class of signalling molecules that play important roles in the development, regulating cell proliferation, differentiation, migration and transformation. Moreover, deregulation of several PTPs contributes to the pathogenesis of human diseases. As a result, substantial research over the last decade has focused on the structure and function of PTPs, and a number of these enzymes are now being tested as potential pharmaceutical targets. Considering these assumptions, we focused on Protein Tyrosine Phosphatase gamma (PTPRG), a receptor-like transmembrane protein belonging to the family of classical protein tyrosine phosphatases. PTPRG is known to regulate haematopoietic differentiation in a murine embryonic stem cells model and to be involved as a putative tumor suppressor gene in kidney, lung, colon, ovarian and breast cancers. Our studies, supported by the unique tools we developed, lead us to recognize new features for this phosphatase including a critical role in the pathogenesis of chronic myeloid leukemia. Aims: 1) set up or develop new tools for analysis of PTPRG; 2) study PTPRG expression in normal tissue, 3) study PTPRG expression in neoplasia, 4) identification of the functional role of PTPRG Methods: Haematopoietic cells purification and culture, Flow Cytometry, Immunostaining of cells and tissues (Immunofluorescence and immunohistochemistry), Reverse transcription–polymerase chain reaction (PCR), Real-time quantitative reverse transcriptase (RT)-PCR, Western Blot analysis Results: Aim 1: We developed a QPCR assay, developed a new antibody suitable for flow cytometric detection of PTPRG, set up the conditions for immunohistochemical staining of paraffin embedded tissues for three different antibodies. Aim 2: Expression in normal tissue: a) PTPRG: is a new biomarker for monocytes, dendritic cells and specialized macrophages; b) PTPRG is highly expressed by CD34+ circulating precursors, c) PTPRG is highly expressed by endocrine cells and is probably cleaved in vivo, d) PTPRG is highly expressed by endothelium and epithelial cells. Aim 3: PTPRG in neoplasia: a ) We demonstrated a marked loss of PTPRG immunoreactivity in subsets of ovarian (21%), breast (56%) and lung (80%) neoplasms. Conversely, cytoplasmic positivity was found in 37% of lymphomas, mainly of high grade histotypes, while normal lymphocytes were negative. Brain tissue showed PTPRG expression in a few neuronal and glial elements and PTPRG was overexpressed in the majority of high-grade astrocytomas. b) PTPRG is specifically down modulated in CML patients in both peripheral blood and bone marrow, including in CD34+ cells, and is re-expressed following molecular remission of the disease Aim 4: functional studies: a) PTPRG in CML: PTPRG is down-regulated in chronic myeloid leukemia (CML) cell lines where reduced expression correlates with higher clonogenicity and proliferation, while overexpression inhibits both parameters. Clonogenicity is unaffected while proliferation is partially inhibited by the expression of a phosphatase inactive mutant; b) PTPRG is modulated during haemopoietic differentiation of CD34+ cells; c ) PTPRG expression correlates with a tolerogenic phenotype in dendritic cells Conclusions: We propose PTPRG as a new functionally regulated leukocyte marker whose precise role in normal and pathological context deserve further investigation. We described particularly high PTPRG expression in endocrine cells and both down and up-regulation in neoplasia, the latter possibly reflecting the undifferentiated state of the neoplastic cells, suggesting a complex role for this phosphatase.