FUNCTIONAL PROTEOMIC ANALYSIS OF COMPLEMENT PROTEINS FROM PATIENTS WITH SYSTEMIC SCLEROSIS

La sclerodermia (SSc) è una malattia del connettivo che si caratterizza per un eccesivo deposito di collagene a livello di cute e organi interni. Essa è associata a un’anomala risposta immune e a un danno del microcircolo, che è considerato una delle manifestazioni più precoci della malattia. Il presente progetto di ricerca è nato come il proseguimento di un’analisi proteomica comparativa condotta su siero di soggetti con SSc, che aveva evidenziato il Fattore H (FH) del complemento come una delle proteine differentemente espresse tra pazienti e controlli sani. Dato l’importante ruolo svolto dal FH nella regolazione del complemento sia nella fase fluida sia a livello delle membrane endoteliali dell’ospite, si è deciso di approfondire l’analisi di tale una molecola, per verificare se eventuali anomalie nel FH potessero essere coinvolte nella patogenesi di questa malattia. Tramite due tecniche complementari, western blot ed ELISA, sono stati confermati gli aumentati livelli di FH nel siero dei malati rispetti ai soggetti sani di controllo. E’ stata inoltre esaminata l’attivazione del complemento nella SSc, tuttora oggetto di dibattito, sia in toto che nella via alternativa, ma non sono state rilevate anomalie significative. Abbiamo quindi valutato la funzione del FH nella fase fluida e la sua interazione con alcuni ligandi, C3b ed eparina, documentando anche in questo caso l’assenza di anomalie. Saggi di emolisi hanno invece evidenziato un’aumentata lisi di eritrociti di pecora in seguito all’aggiunta del siero dei malati rispetto ai valori osservati con sieri controllo. Inoltre, abbiamo verificato che la pre-incubazione degli eritrociti con FH, commerciale o purificato da soggetti sani, ne preveniva la lisi quando questi venivano incubati con il siero dei pazienti. La ricerca di anticorpi diretti contro il FH, che è ancora in fase iniziale e pertanto richiede ulteriori approfondimenti e verifiche, ha evidenziato la presenza di autoanticorpi in una piccola percentuale di malati. Dal momento che l’analisi genetica non ha evidenziato mutazioni a carico del FH, riteniamo che le anomalie sopra riportate potrebbero essere dovute o alla presenza di autoanticorpi, i cui epitopi sono ancora da localizzare, o a modifiche post-traduzionali del FH che potrebbero averne alterato la funzionalità. Anche alterazioni nella dimerizzazione o complessi tra FH e qualcuno dei suoi molteplici ligandi potrebbero avere un ruolo nell’eziopatogenesi della malattia. Infine, i pazienti con SSc potrebbero avere alterazioni a carico di altre molecole che regolano la cascata del complemento e che in modo diretto o indiretto interagiscono con il FH. Pertanto, pur esplorando solo alcuni aspetti della complessa della rete di interazioni tra i vari componenti del complemento, il presente studio suggerisce che anomalie nella regolazione del complemento potrebbero avere un ruolo nell’eziopatogenesi della SSc e potrebbe quindi essere il punto di partenza per studi funzionali più mirati.

Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune disease characterized by excessive collagen deposition in skin and internal organs. An abnormal immunological response and microvascular damage appear to be early events in the pathophysiology of SSc. This research project follows a previous proteomic comparative analysis on serum, which had identified Factor H as one of the proteins differently expressed between SSc patients and healthy controls. Since FH has a fundamental role either in complement fluid phase regulation and host cell membrane protection, we focused our attention on this molecule, in the attempt of clarifying its eventual role in SSc pathogenesis. First of all, we confirmed by two complementary techniques, WB and ELISA, increased FH serum levels in SSc patients. We also analyzed complement activation in our patients, whose involvement in SSc is still matter of debate, without detecting significative abnormalities. No defects were found either in FH fluid phase activity and interaction with some ligands, i.e. C3b and heparin, evaluated comparing purified FH samples from SSc patients and controls. We observed an high hemolytic activity of SSc sera towards sheep RBCs compared to control sera, which is reversed by pre-incubation with commercial or healthy purified FH. Anti-FH antibodies were detected in a small percentage of patients, although a further screening on a wider cohort of subjects and the epitope-mapping are still on course. Since the genetical analysis did not reveal mutations in FH, we think the reported observations might be explained by anti-FH antibodies or post translational modifications which could block FH membrane activity. Also abnormalities in FH dimerization or complexes between FH and any of its many ligands might have a pathogenetic effect. Finally, SSc patients might present alterations in other complement regulators directly or indirectly connected to FH. In conclusion, our study proposed a new hypothesis on SSc etiopathogenesis and, although not exploring all the existing connection among the complement players and not reaching definitive conclusions, provided some hints about a possible dysfunction in complement regulation, which could be the starting point of more targeted functional studies.