Humanization of murine neutralizing monoclonal antibodies against HIV-1 through a new approach based on lentiviral vectors

A più di 25 anni dalla scoperta del virus HIV, l'AIDS rappresenta ancora un'emergenza pandemica. Le terapie antiretrovirali stanno diventando sempre più efficaci, ma non è stata ancora trovata una vera cura. Al fine di sviluppare un vaccino preventivo, è fondamentale l'isolamento di nuovi immunogeni, in grado di stimolare la risposta immunitaria umorale verso epitopi virali altamente conservati. Nel nostro laboratorio, sono stati prodotti intermedi di fusione che esponessero epitopi virali conservati. Tali complessi di fusione sono stati utilizzati per immunizzare dei topi in modo da sollecitare la produzione di anticorpi, e per produrre ibridomi che esprimessero anticorpi contro HIV-1. Nel corso del presente lavoro di tesi, popolazioni di ibridomi sono state sottoposte a screening per testare la produzione di anticorpi e l'attività neutralizzante. Le cellule sono state subclonate in passaggi successivi fino a popolazioni derivate da singola cellula al fine di individuare anticorpi monoclonali ad ampio spettro. Al fine di stabilizzare l'espressione degli anticorpi, e di ottenere anticorpi simili ad anticorpi umani, le sequenze di mRNA di IgG della popolazione monoclonale selezionata sono state clonate per essere umanizzate. Vettori virali esprimenti catene umanizzate leggere e pesanti di IgG sono stati prodotti clonando le regioni costanti umane in frame con le regioni variabili murine. Tali vettori virali sono stati usati per co-infettare cellule CHO in modo da ottenere una linea cellulare che esprimesse stabilmente anticorpi umanizzati. L’integrazione dei transgeni è stata confermata dall’amplificazione del DNA genomico e la produzione di anticorpi umanizzati è stata quantificata mediante test ELISA. I risultati ottenuti mostrano che i vettori virali sono in grado di integrare i transgeni all'interno delle cellule bersaglio e, più precisamente, che il nostro metodo funziona per la produzione di anticorpi umanizzati. Inoltre, i test preliminari mostrano che l'anticorpo prodotto denota attività interessante. Tuttavia, tale protocollo deve essere messo a punto e ottimizzato, in quanto l’espressione di anticorpi è su valori di concentrazione troppo bassi per la produzione in larga scala. L’ottimizzazione di questo metodo e dei test di funzionalità degli anticorpi permetterà la pubblicazione di un protocollo rapido e semplice per produrre linee cellulari che esprimano stabilmente l'anticorpo di interesse. La caratterizzazione e l’analisi degli anticorpi sarà quindi favorita da una espressione stabile.

More than 25 years after the discovery of HIV, AIDS still represents a pandemic emergency. Antiretroviral therapies are becoming more and more effective, but no real cure has yet been found to eradicate it. In order to develop a preventive vaccine, the isolation of new immunogens, capable to stimulate humoral immune response towards highly conserved viral epitopes, is pivotal. In a past work performed by our lab, the fusion between HIV-1 envelope and cell membrane was exploited to produce fusion intermediates exposing viral conserved epitopes. Such fusion complexes were used to immunize mice to elicit antibody production, and to produce hybridomas population expressing antibodies against HIV-1. During the course of the present work of thesis, hybridoma populations were screened for antibody production and neutralization activity. Cells were gradually subcloned down to single cell population in order to identify broad-spectrum monoclonal antibodies. In order to stabilize antibody expression, and to obtain antibodies supernatants close to human antibody, IgG mRNA sequences of the selected monoclonal population were cloned to be humanized. Viral vectors expressing humanized light and heavy IgG chains were produced by matching human constant regions with murine variable regions. Such viral vectors were used to co-infect CHO cells in order to obtain a cell line stably expressing humanized antibodies. Transgenes integration was confirmed by amplification of genomic DNA and humanized antibody production was quantified by ELISA assay. Obtained results show that viral vectors can integrate transgenes inside target cells and, more precisely, that our method works to produce humanized antibodies. Moreover, preliminary functional tests show that the produced antibody is working. Nevertheless, such protocol needs to be devised, as antibody expression remained at low concentration values to perform functionality assays. Optimization of this method and tests of antibody functionality will allow to the release of a rapid and easy protocol to produce cell line stably expressing the antibody of interest. Antibody characterization and analysis could be favored by a stable production source.