STRUCTURAL STUDIES OF HUMAN PROTEINS OF MEDICAL INTEREST

L'obiettivo di questo lavoro di tesi era determinare la struttura tridimensionale di tre proteine umane, Heat shock protein 60 (HSP60), Activation-induced cytidine deaminase (AICDA) e Cholesterol 7-alpha-monooxygenase (CYP7A1), attraverso la tecnica di diffrazione di raggi X. La chaperonina umana HSP60 è una proteina mitocondriale, espressa in maniera costitutiva. La proteina è stata espressa in E. coli e purificata tramite cromatografia di affinità immobilizzata dello ione metallo, utilizzando un tag di sei istidine inserito all'estremità N-terminale della proteina, e tramite cromatografia a esclusione molecolare. Le prove di cristallizzazione non danno risultati positivi, probabilmente per problemi di eterogeneità della proteina. La AICDA umana è una citidina deaminasi, la quale è selettivamente espressa nei linfociti B e svolge un ruolo cruciale nell'ipermutazione somatica e nella ricombinazione per scambio di classe degli anticorpi. L'espressione della proteina è stata tentata in E. coli con differenti vettori ed è stata ottenuta con successo con il plasmide pGEX-4T-1, che permette di esprimere la GST all'estremità N terminale della proteina oggetto di studio; sfortunatamente, il protocollo di purificazione non è stato efficace. La CYP7A1 è un enzima microsomale che catalizza la conversione del colesterolo a 7α-idrossicolesterolo, la prima reazione della sintesi degli acidi biliari, e questa è la reazione limitante la velocità della via metabolica; la proteina è espressa solamente nel fegato. L'espressione della proteina umana CYP7A1 in E. coli è stata difficoltosa e, sebbene siano stati testati differenti vettori, non è stato ottenuto un buon livello di espressione della proteina. Per superare questi problemi, la CYP7A1 di pesce zebra (Danio rerio) è stata espressa in E. coli, ma senza apprezzabili miglioramenti. Un'altra parte della mia tesi ha riguardato la determinazione della struttura tridimensionale della Methionine aminopeptidase 1 umana con due differenti inibitori. La proteina catalizza l'eliminazione della metionina N-terminale dalle proteine nascenti. Inibitori contro questa proteina sono di grande interesse medico grazie al loro potenziale impiego come farmaci antitumorali. Questa parte di tesi è stata svolta presso il laboratorio del Dr. L. Mario Amzel sotto la supervisione della Dr. Sandra B. Gabelli - Department of Biophysics and Biophysical Chemistry, Johns Hopkins University, School of Medicine (Baltimore, USA).

The aim of this thesis work was to determine the three-dimensional structure of three human proteins, Heat shock protein 60 (HSP60), Activation-induced cytidine deaminase (AICDA) and Cholesterol 7-alpha-monooxygenase (CYP7A1), by X-ray diffraction of single crystals. The human chaperonine HSP60 is a mitochondrial protein, expressed in a constitutive manner. The protein was expressed in E. coli and purified by immobilized metal ion affinity chromatography, using a histidine tag fused to the N-terminus of the protein, and by size exclusion chromatography. The crystallization trials do not give positive results, probably due to protein heterogeneity problems. Human AICDA is a cytidine deaminase, which is selectively expressed in B lymphocytes and plays a crucial role in antibody somatic hypermutation and class switch recombination. Protein expression was attempted in E. coli with different vectors and was successfully achieved with the pGEX-4T-1 plasmid, that allows to express GST at the N-terminus of the target protein; unfortunately, the purification protocol was not effective. CYP7A1 is a microsomal enzyme that catalyzes the conversion of cholesterol to 7α-hydroxycholesterol, the first reaction of bile acid synthesis and the rate-limiting step of the metabolic pathway; the protein is expressed only in the liver. The expression of human CYP7A1 in E. coli was troublesome and, although different vectors were tested, a good level of protein expression was not obtained. In order to overcome these problems, zebrafish (Danio rerio) CYP7A1 was expressed in E. coli, but without any substantial improvement. Another part of this thesis work concerned the determination of the three-dimensional structure of the human Methionine aminopeptidase 1 with two different inhibitors. The protein catalyzes the removal of the N-terminal methionine from nascent proteins. Inhibitors against this protein are of great medical interest because of their potential employment as anticancer drugs. This part of the thesis was performed at Dr. L. Mario Amzel's laboratory under the direct supervision of Dr. Sandra B. Gabelli - Department of Biophysics and Biophysical Chemistry, Johns Hopkins University, School of Medicine (Baltimore, USA).