L’uso di tecniche avanzate di imaging dell’encefalo combinato con l’utilizzo di animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti fornisce attualmente uno strumento di frontiera per la visualizzazione ad alta risoluzione di eventi biologici dinamici, a livello cellulare e sub-cellulare, che si verificano in vivo. Il presente progetto di tesi di Dottorato si è rivolto sulla caratterizzazione ed allo studio, mediante microscopia a due fotoni, di una popolazione di cellule mobili osservata sulle superficie dell’encefalo di topi transgenici GFP-M. Questa linea murina è stata ingegnerizzata per ottenere l’espressione di green fluorescent protein (GFP) in cica il 10% dei neuroni, distribuiti in varie regioni del sistema nervoso. Tuttavia non erano state finora caratterizzate, in questo modello murino, cellule non neuronali marcate con GFP. La prima serie degli esperimenti presentati in questa tesi si è focalizzata sulla caratterizzazione di tali cellule non neuronali marcate con GFP nei topi GFP-M. Con l’uso della microscopia a due fotoni, tramite diversi approcci di osservazione (la chronic optical brain window e la thinned skull preparation), queste cellule fluorescenti sono state osservate nelle meningi, negli strati superficiali della corteccia cerebrale subito al di sotto delle meningi e negli spazi perivascolari. Sono stati occasionalmente osservati movimenti di tali cellule dalle superfici piale e subpiale verso il parenchima encefalico, con evidenti variazioni della loro forma. Analisi in microscopia confocale di sezioni di encefalo hanno mostrato che tali cellule sono immuno-negative per molti antigeni neuronali, inclusi quelli espressi da progenitori neuronali, ed esprimono invece antigeni caratteristici delle cellule dendritiche (dendritic cells, DCs) e, in particolare, antigeni del complesso maggiore di istocompatibilità di classe II (MHC-II) e CD11c. Mediante queste ed ulteriori analisi, incluse valutazioni quantitative, la prima serie di esperimenti ha consentito di identificare le cellule non neuronali GFP-positive osservate alla superficie dell’encefalo di topi GFP-M come una sotto-popolazione di DCs, che, di fatto, ne rappresenta la maggioranza. Nella seconda serie di esperimenti, sono state esaminate le DCs GFP-positive in un modello di neuroinfiammazione cronica rappresentato dall’infezione con il parassita Trypanosoma brucei (T.b.), l’agente eziologico della tripanosomiasi umana africana. denominata anche malattia del sonno. Il parassita causa anche infezione in animali. E’ stato quindi allestito un modello sperimentale infettando topi GFP-M con T.b. brucei (non patogeno per l’uomo e che quindi consente il lavoro di laboratorio in condizioni di sicurezza). Sia nell’uomo che nell’animale la tripanosomiasi africana evolve in due stadi: un primo stadio, emolinfatico, di infezione sistemica, che evolve nel secondo stadio, meningoencefalitico, quando il parassita attraversa la barriera emato-encefalica ed invade il parenchima cerebrale. I topi GFP-M infettati con il parassita sono stati esaminati con la microscopia a due fotoni utilizzando, come campionamento, due punti temporali: il primo durante la fase iniziale di invasione del parenchima encefalico da parte del parassita (16 giorni dopo l’infezione) ed il secondo in una fase più avanzata (22 giorni). In topi GFP-M di controllo (non infetti) le DCs sono sessili e localizzate principalmente nelle meningi, mentre a 16 giorni dopo l’infezione è stato osservato che le DCs si concentrano nel parenchima cerebrale, all’interno del quale mostrano una notevole mobilità. E’ stato inoltre osservato che alcune DCs mostrano adesione ad endoteli vascolari e rotolamento su di essi. Di particolare interesse è l’osservazione nel parenchima encefalico, nella fase avanzata dell’infezione (22 giorni), di gruppi di DCs caratterizzati da movimenti dinamici delle loro membrane, che indicano attività fagocitica. Il confronto di parametri di motilità delle DCs (velocità media, coefficiente di motilità e meandering factor) fra questi due punti temporali ha consentito di dimostrare che le DCs effettuano inizialmente movimenti rapidi di esplorazione, mentre in una fase successiva i movimenti si attuano in un volume di tessuto più limitato e con una diminuzione della loro velocità. Queste caratteristiche potrebbero indicare una efficiente presentazione dell’antigene ai linfociti da parte delle DCs. In conclusione, il progetto di tesi di Dottorato ha rivelato per la prima volta l’esistenza di DCs fluorescenti in topi GFP-M, che possono quindi essere utilizzati come nuovo modello murino per lo studio di queste cellule che svolgono un ruolo chiave nella risposta immunitaria. Tali indagini hanno consentito di analizzare il comportamento delle DCs in condizioni fisologiche e patologiche. I risultati indicano, inoltre, che le DCs potrebbero svolgere un ruolo di rilievo nei meccanismi patogenetici di infezione dell’encefalo durante la tripanosomiasi africana.

The combination of the most advanced brain imaging techniques and transgenic animals expressing fluorescent proteins has provided a powerful tool to visualize with high-resolution dynamic biological processes that occur in vivo at the cellular and subcellular levels. The present doctoral thesis project has been aimed at the characterization and investigation, with two-photon microscopy, of a motile population of cells observed at the brain surface in GFP-M transgenic mice. This mouse line has been engineered for the expression of green fluorescent protein (GFP) in about 10% of the neurons at different locations, but GFP-labeled non-neuronal cells had not been previously characterized. The first extensive experimental series presented in this thesis focuses on the characterization of these non-neuronal GFP-tagged cells in GFP-M mice. In two-photon microscopy, through a chronic optical brain window and in a thinned skull preparation, such fluorescent cells have been observed in the meninges, in the upper cortical layers close to meninges as well as in perivascular spaces, occasionally moving from the pial and subpial surface into the brain parenchyma with evident changes of shape. Confocal microscopy analyses on cryosectioned brain sections has shown that these cells are immunonegative to several neuronal antigens, including those of neuronal progenitors, while they express antigens most commonly expressed by dendritic cells (DCs), namely major histocompatibility complex class II (MHC-II), and CD11c. Together with other analyses, including quantitative evaluation, the first experimental series has allowed to identify GFP-labeled non-neuronal cells in GFP-M mice as a subset of DCs, accounting for the majority of these cells in the brain of GFP-M mice. In the second experimental series of the doctoral thesis project, GFP-labeled DCs have been examined in a model of chronic neuroinflammation represented by infection with Trypanosoma brucei (T.b.). This parasite is the causative agent of the severe disease human African trypanosomiasis (also called sleeping sickness) and causes infections also in animals. The experimental model has been set up by infecting GFP-M mice with the parasite subspecies T.b. brucei (which is not pathogenic for humans and therefore safe for laboratory work). In humans and in animals African trypanosome infection progresses in two stages: a first hemolymphatic stage of systemic invasion, which evolves in the second, meningoencephalitic stage when the parasites cross the blood-brain barrier and invade the brain parenchyma. Infected GFP-M mice have been analyzed by multiphoton microscopy at two time points during the meningoencephalitic stage of the disease: early after the initial parasite invasion of the brain parenchyma (at 16 days post-infection, dpi) and at a more advanced phase (22 dpi). The results of the present investigation have shown that in the healthy brain of control GFP-M mice sessile DCs are mainly localized in meninges, whereas in T.b. brucei-infected animals at 16 dpi DCs have been observed to accumulate within the brain parenchyma, where they exhibited high motility. Moreover, some DCs showed adhesion and crawling on vascular endothelia. Interestingly, at an advanced phase of the infection (22 dpi), DC clusters with very dynamic membrane extensions, indicating active phagocytic events, were observed in the brain parenchyma. Comparing parameters of the DCs motility (mean velocity, motility coefficient, meandering factor) at these two time points, DCs appeared initially in rapid probing motions, and exhibited later motility in a more restricted tissue volume and their velocity decreased. These features could be aimed at an efficient antigen presentation to T-cells. In conclusion, the doctoral thesis project has shown for the first time the presence of fluorescent DCs in GFP-M mice, which thus could be used as a novel animal model for the study of these key actors of immunity. This finding has allowed to investigate the in vivo behavior of DCs in both basal and pathological conditions. Moreover, the data here obtained suggest that DCs could play a key role in pathogenic mechanisms of brain infection during African trypanosomiasis.

Characterization of a motile population of cells in the cerebral cortex and meninges of thy1GFP-M transgenic mice by multiphoton microscopy

LAPERCHIA, Claudia
2011-01-01

Abstract

The combination of the most advanced brain imaging techniques and transgenic animals expressing fluorescent proteins has provided a powerful tool to visualize with high-resolution dynamic biological processes that occur in vivo at the cellular and subcellular levels. The present doctoral thesis project has been aimed at the characterization and investigation, with two-photon microscopy, of a motile population of cells observed at the brain surface in GFP-M transgenic mice. This mouse line has been engineered for the expression of green fluorescent protein (GFP) in about 10% of the neurons at different locations, but GFP-labeled non-neuronal cells had not been previously characterized. The first extensive experimental series presented in this thesis focuses on the characterization of these non-neuronal GFP-tagged cells in GFP-M mice. In two-photon microscopy, through a chronic optical brain window and in a thinned skull preparation, such fluorescent cells have been observed in the meninges, in the upper cortical layers close to meninges as well as in perivascular spaces, occasionally moving from the pial and subpial surface into the brain parenchyma with evident changes of shape. Confocal microscopy analyses on cryosectioned brain sections has shown that these cells are immunonegative to several neuronal antigens, including those of neuronal progenitors, while they express antigens most commonly expressed by dendritic cells (DCs), namely major histocompatibility complex class II (MHC-II), and CD11c. Together with other analyses, including quantitative evaluation, the first experimental series has allowed to identify GFP-labeled non-neuronal cells in GFP-M mice as a subset of DCs, accounting for the majority of these cells in the brain of GFP-M mice. In the second experimental series of the doctoral thesis project, GFP-labeled DCs have been examined in a model of chronic neuroinflammation represented by infection with Trypanosoma brucei (T.b.). This parasite is the causative agent of the severe disease human African trypanosomiasis (also called sleeping sickness) and causes infections also in animals. The experimental model has been set up by infecting GFP-M mice with the parasite subspecies T.b. brucei (which is not pathogenic for humans and therefore safe for laboratory work). In humans and in animals African trypanosome infection progresses in two stages: a first hemolymphatic stage of systemic invasion, which evolves in the second, meningoencephalitic stage when the parasites cross the blood-brain barrier and invade the brain parenchyma. Infected GFP-M mice have been analyzed by multiphoton microscopy at two time points during the meningoencephalitic stage of the disease: early after the initial parasite invasion of the brain parenchyma (at 16 days post-infection, dpi) and at a more advanced phase (22 dpi). The results of the present investigation have shown that in the healthy brain of control GFP-M mice sessile DCs are mainly localized in meninges, whereas in T.b. brucei-infected animals at 16 dpi DCs have been observed to accumulate within the brain parenchyma, where they exhibited high motility. Moreover, some DCs showed adhesion and crawling on vascular endothelia. Interestingly, at an advanced phase of the infection (22 dpi), DC clusters with very dynamic membrane extensions, indicating active phagocytic events, were observed in the brain parenchyma. Comparing parameters of the DCs motility (mean velocity, motility coefficient, meandering factor) at these two time points, DCs appeared initially in rapid probing motions, and exhibited later motility in a more restricted tissue volume and their velocity decreased. These features could be aimed at an efficient antigen presentation to T-cells. In conclusion, the doctoral thesis project has shown for the first time the presence of fluorescent DCs in GFP-M mice, which thus could be used as a novel animal model for the study of these key actors of immunity. This finding has allowed to investigate the in vivo behavior of DCs in both basal and pathological conditions. Moreover, the data here obtained suggest that DCs could play a key role in pathogenic mechanisms of brain infection during African trypanosomiasis.
2011
dendritic cells; thy1GFP-M mice; multiphoton microscopy; trypanosomiasis
L’uso di tecniche avanzate di imaging dell’encefalo combinato con l’utilizzo di animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti fornisce attualmente uno strumento di frontiera per la visualizzazione ad alta risoluzione di eventi biologici dinamici, a livello cellulare e sub-cellulare, che si verificano in vivo. Il presente progetto di tesi di Dottorato si è rivolto sulla caratterizzazione ed allo studio, mediante microscopia a due fotoni, di una popolazione di cellule mobili osservata sulle superficie dell’encefalo di topi transgenici GFP-M. Questa linea murina è stata ingegnerizzata per ottenere l’espressione di green fluorescent protein (GFP) in cica il 10% dei neuroni, distribuiti in varie regioni del sistema nervoso. Tuttavia non erano state finora caratterizzate, in questo modello murino, cellule non neuronali marcate con GFP. La prima serie degli esperimenti presentati in questa tesi si è focalizzata sulla caratterizzazione di tali cellule non neuronali marcate con GFP nei topi GFP-M. Con l’uso della microscopia a due fotoni, tramite diversi approcci di osservazione (la chronic optical brain window e la thinned skull preparation), queste cellule fluorescenti sono state osservate nelle meningi, negli strati superficiali della corteccia cerebrale subito al di sotto delle meningi e negli spazi perivascolari. Sono stati occasionalmente osservati movimenti di tali cellule dalle superfici piale e subpiale verso il parenchima encefalico, con evidenti variazioni della loro forma. Analisi in microscopia confocale di sezioni di encefalo hanno mostrato che tali cellule sono immuno-negative per molti antigeni neuronali, inclusi quelli espressi da progenitori neuronali, ed esprimono invece antigeni caratteristici delle cellule dendritiche (dendritic cells, DCs) e, in particolare, antigeni del complesso maggiore di istocompatibilità di classe II (MHC-II) e CD11c. Mediante queste ed ulteriori analisi, incluse valutazioni quantitative, la prima serie di esperimenti ha consentito di identificare le cellule non neuronali GFP-positive osservate alla superficie dell’encefalo di topi GFP-M come una sotto-popolazione di DCs, che, di fatto, ne rappresenta la maggioranza. Nella seconda serie di esperimenti, sono state esaminate le DCs GFP-positive in un modello di neuroinfiammazione cronica rappresentato dall’infezione con il parassita Trypanosoma brucei (T.b.), l’agente eziologico della tripanosomiasi umana africana. denominata anche malattia del sonno. Il parassita causa anche infezione in animali. E’ stato quindi allestito un modello sperimentale infettando topi GFP-M con T.b. brucei (non patogeno per l’uomo e che quindi consente il lavoro di laboratorio in condizioni di sicurezza). Sia nell’uomo che nell’animale la tripanosomiasi africana evolve in due stadi: un primo stadio, emolinfatico, di infezione sistemica, che evolve nel secondo stadio, meningoencefalitico, quando il parassita attraversa la barriera emato-encefalica ed invade il parenchima cerebrale. I topi GFP-M infettati con il parassita sono stati esaminati con la microscopia a due fotoni utilizzando, come campionamento, due punti temporali: il primo durante la fase iniziale di invasione del parenchima encefalico da parte del parassita (16 giorni dopo l’infezione) ed il secondo in una fase più avanzata (22 giorni). In topi GFP-M di controllo (non infetti) le DCs sono sessili e localizzate principalmente nelle meningi, mentre a 16 giorni dopo l’infezione è stato osservato che le DCs si concentrano nel parenchima cerebrale, all’interno del quale mostrano una notevole mobilità. E’ stato inoltre osservato che alcune DCs mostrano adesione ad endoteli vascolari e rotolamento su di essi. Di particolare interesse è l’osservazione nel parenchima encefalico, nella fase avanzata dell’infezione (22 giorni), di gruppi di DCs caratterizzati da movimenti dinamici delle loro membrane, che indicano attività fagocitica. Il confronto di parametri di motilità delle DCs (velocità media, coefficiente di motilità e meandering factor) fra questi due punti temporali ha consentito di dimostrare che le DCs effettuano inizialmente movimenti rapidi di esplorazione, mentre in una fase successiva i movimenti si attuano in un volume di tessuto più limitato e con una diminuzione della loro velocità. Queste caratteristiche potrebbero indicare una efficiente presentazione dell’antigene ai linfociti da parte delle DCs. In conclusione, il progetto di tesi di Dottorato ha rivelato per la prima volta l’esistenza di DCs fluorescenti in topi GFP-M, che possono quindi essere utilizzati come nuovo modello murino per lo studio di queste cellule che svolgono un ruolo chiave nella risposta immunitaria. Tali indagini hanno consentito di analizzare il comportamento delle DCs in condizioni fisologiche e patologiche. I risultati indicano, inoltre, che le DCs potrebbero svolgere un ruolo di rilievo nei meccanismi patogenetici di infezione dell’encefalo durante la tripanosomiasi africana.
File in questo prodotto:
File Dimensione Formato  
Claudia_Laperchia_Doctoral_Thesis_April2011.pdf

non disponibili

Tipologia: Tesi di dottorato
Licenza: Accesso ristretto
Dimensione 21.23 MB
Formato Adobe PDF
21.23 MB Adobe PDF   Visualizza/Apri   Richiedi una copia

I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11562/351391
Citazioni
  • ???jsp.display-item.citation.pmc??? ND
  • Scopus ND
  • ???jsp.display-item.citation.isi??? ND
social impact