Structural features of catechins responsible for inhibitory action on signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1)

Studi epidemiologici e ricerche sperimentali hanno rivelato che il tè verde ha molte proprietà sia come agente antitumorale che antiinfiammatorio. Tra tutti i polifenoli presenti nel tè verde, molti lavori mostrano che l’epigallocatechina gallato (EGCG) è il principale principio attivo in quanto esso è in grado di inibire l’angiogenesi, l’urochinasi, le metalloproteinasi e l’induzione dell’ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS). Gli effetti benefici del tè verde si pensavano essere attribuiti alle spiccate proprietà antiossidanti dei polifenoli in esso contenuti, ma dati ottenuti negli anni passati nel nostro laboratorio hanno evidenziato una diversa azione più specifica. Signal Transducers and Activators of Trascription (STATs) sono una famiglia di fattori trascrizionali che mediano l’azione di citochine coinvolte in numerose funzioni biologiche. Tra tutte la catechine presenti nel tè verde, solo EGCG era in grado di inibire l’attivazione del fattore trascrizionale Signal Transducer and Activator of Trascription 1 (STAT1), indotta dalla citochina interferone gamma (IFNgamma). L’attivazione di STAT1, indotta da IFNgamma, fa parte di alcune vie di trasduzione del segnale che innescano numerosi processi infiammatori, ed è necessaria per l’espressione di molteplici geni pro-infiammatori quali iNOS e il complesso maggiore di istompatibilità di calsse II DR alfa (MCH II DRA). La loro attivazione è stata riscontra in numerose malattie e EGCG, essendo in grado di inibirne l’espressione, risulta essere un buon coadiuvante nel trattamento di patologie infiammatorie STAT1 dipendenti. 15 nuove catechine gallato con struttura chimica analoga alla gallocatechina gallato (GCG), diastereoisomero trans dell’EGCG, sono state sintetizzate per il lavoro di ricerca qui proposto. Queste catechine di sintesi presentano un ridotto numero di ossidrili legati ai vari anelli della struttura rispetto alla GCG, composto di riferimento. I composti 2 e 3 presentano un minor numero di ossidrili sull’anello A, i composti 4, 5 e 6 mostrano una riduzione di ossidrili sull’anello B, i composti 7, 8, 9 e 10 presentano modifiche sull’anello D, mentre i composti rimanenti portano riduzioni di ossidrili su più anelli contemporaneamente. Lo studio ha permesso di verificare: 1) In una linea cellulare di carcinoma mammario MDA MB 231, la capacità dei composti di sintesi studiati di inibire l’attivazione di STAT1 indotta da IFNgamma, allo scopo di individuare la porzione di molecola minima necessaria e sufficiente per garantirne l’attività. I dati ottenuti indicano che la presenza di tre ossidrili in posizione 3', 4' e 5' dell’anello B, e di almeno un ossidrile nell’anello D rendono le catechine capaci di inibire la fosforilazione di STAT1 in Tyr701 e Ser727, di bloccare il legame di STAT1 al DNA ed di impedire l’espressione di geni STAT1 dipendenti iNOS e MCH II DRA. 2) La diretta interazione tra la proteina STAT1 ricombinante e le catechine attive. L’ipotesi che, lungo la via IFNgamma/STAT1, il target molecolare delle catechine studiate potesse essere la proteina STAT1 stessa è stata verificata mediante Surface Plasmon Resonance (SPR), Molecular Modelling, studi di mutagenesi sito specifica e saggi chinasici tra la proteina ricombinate STAT1 e l’enzima ricombinate Janus Kinase 2 (JAK2). I nostri dati hanno permesso di suggerire un possibile, specifico ed efficiente meccanismo d’inibizione dell’attivazione di STAT1, da parte delle catechine. Ciò può rappresentare un punto d’inizio per lo sviluppo di nuovi composti capaci di modulare selettivamente l’attivazione di STAT1, utili nella prevenzione o terapia di patologie infiammatorie.

In the last years, a great interest is emerging about green tea as a tool against human cancer development or inflammation, as pointed out by many reports describing the inhibitory action of epigallocatechin gallate (EGCG), the main polyphenol component of green tea, on angiogenesis, urokinase, metalloproteinases, and induction of inducible nitric oxide synthase (iNOS). The beneficial effect is believed to be due to their strong antioxidant activity. However, our laboratory evidence indicates the involvement of a more specific action. Signal Transducers and Activators of Transcription (STATs) are nuclear factors mediating the action of cytokines involved in various biological functions. Among a number of catechins present in green tea extract, only epigallocatechin gallate (EGCG) exerts a strong inhibitory action on interferon gamma (IFNgamma)-elicited activation of Signal Transducer and Activator of Transcription 1 (STAT1). IFNγ-elicited STAT1 activation is important for iNOS and other STAT1 dependent genes expression, as major histocompatibility complex class II DR alpha (MCH II DRA). 15 new compounds, obtained by chemical modification of gallocatechin gallete (GCG), diastereomer of EGCG, were synthesized. They present fewer hydroxyl groups than GCG in ring A (compounds 1, 2 and 3) or in ring B (compounds 4, 5 and 6) or in ring D (compounds 7, 8, 9 and 10), or simultaneously in more than one ring (compounds 11, 12, 13, 14 and 15). In this work we show: 1) The ability of some of this new synthetic compounds to inhibit IFNgamma-elicited activation of STAT1, in human MDA MB 231 cell line, by showing the minimal chemical features necessary and sufficient for this activity. The synthetic catechins with three hydroxyl groups in 3', 4' and 5' of ring B and at least one hydroxyl group in ring D are able to block STAT1 Tyr701 and Ser727 phosphorylation, STAT1 DNA-binding and STAT1 dependent iNOS and MCH II DRA gene expression. 2) The direct interaction between STAT1 recombinant protein and the anti-STAT1 catechins, identifying STAT1 itself as the real molecular target of catechins in the IFNgamma/STAT1 pathway. This data was confirmed by Surface Plasmon Resonance (SPR) analysis, Molecular Modelling studies, Site-direct Mutagenesis, and STAT1- Janus Kinase 2 (JAK2) kinase assay. In conclusion, we suggest a specific molecular mechanism of action of the catechins. These results may be considered the first step to the development of new anti-STAT1 molecules, that can be used as new drugs against inflammatory processes by modulation of STAT1 signaling.