Le piante producono molte migliaia di metaboliti secondari e fino ad oggi dal punto di vista chimico sono noti più di 40000 terpenoidi, 5000 alcaloidi e 20000 composti fenolici. Molti metaboliti secondari, tra cui i composti fenolici, sono stati ampiamente studiati per la loro attività biologica in sistemi animali, sia in vivo che in vitro, ma il ruolo della maggior parte di questi metaboliti nei sistemi vegetali non è ancora noto. È noto che molti stress biotici e abiotici che inducono la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) nelle cellule vegetali inducono anche l’accumulo di fenilpropanoidi, ma quanto realmente essi siano coinvolti nelle reazioni di scavenging dei ROS in vivo non è ancora chiaro. (Hernandez et al., 2009). Le colture in vitro di cellule vegetali sono ampiamente utilizzate come sistemi sperimentali per studiare molti aspetti fisiologici, biochimici e molecolari delle piante. La coltura cellulare R3M di carota è stata selezionata da una coltura non pigmentata per la capacità di produrre antocianine. L’imaging in vivo di singole cellule ha evidenziato che cellule pigmentate sono più resistenti delle cellule non pigmentate ad uno stress di tipo ossidativo. La caratterizzazione metabolica di estratti metanolici di cellule R3M mediante HPLC-DA e HPLC-MS mostra che la linea cellulare produce antociani, acidi idrossicinnamici e acidi idrossibenzoici. Inoltre, l'analisi del metaboloma delle cellule R3M in condizioni di aumentata agitazione mostra una correlazione positiva tra l'accumulo di antociani, di acidi idrossicinnamici e acidi idrossibenzoici. Lo scopo di questo lavoro è l’indagine del possibile ruolo biologico della presenza e della abbondanza relativa di alcuni fenilpropanoidi, in particolare delle antocianine, nella coltura cellulare R3M di carota. L'accumulo di antocianine in cellule R3M è stato incrementato mediante la somministrazione dei precursori biosintetici. L’analisi in HPLC-MS degli estratti metanolici delle cellule ha mostrato l’effetto dei feeding sul metaboloma della coltura e l’analisi statistica multivariata dei dati cromatografici ha permesso il confronto dei diversi trattamenti eseguiti. La diversa capacità delle cellule sottoposte a feeding di rispondere ad uno stress di tipo termico è stata monitorata mediante osservazione al microscopio ottico dei tratti fenotipici riconducibili a danni causati dal calore e mediante valutazione del grado di perossidazione lipidica. Gli esperimenti hanno messo in luce importanti aspetti del ruolo che alcuni fenilpropanoidi hanno in risposta a condizioni ambientali avverse in vivo.

Plants produce many thousands of secondary metabolites and to date from the chemical point of view more than 40,000 terpenoids, 5,000 alkaloids and 20,000 phenolic compounds are known. It is known that many biotic and abiotic stresses that induce the production of reactive oxygen species (ROS) in plant cells induce the accumulation of phenylpropanoids, but if they are really involved in the reactions of scavenging of ROS in vivo is still unclear (Hernandez et al., 2009). In vitro plant cell cultures are widely used as experimental systems for studying many physiological, biochemical and molecular features of plant. R3M carrot cell culture was selected from a non-pigmented culture for their ability to produce anthocyanins. Experiments of in vivo imaging of single cells showed that pigment cells are more resistant than non-pigmented ones to oxidative stress. The metabolic characterization of metanolic extracts of R3M cell cultures by HPLC-DA and HPLC-MS reveals that R3M cell line produces anthocyanins, hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acids. The aim of this doctoral project is an investigation of the possible biological role of the presence and relative abundance of some phenylpropanoids, particularly anthocyanins, in R3M cell culture. The accumulation of anthocyanins has been increased by feeding of biosynthetic precursors. The HPLC-MS analysis of cell methanol extracts has shown the effect of feeding on the R3M metabolic profile; comparison of the treatments has been performed by multivariate statistical analysis of the chromatographic data. The different ability of feeded cells to respond to thermal stress has been analyzed by microscopic observation of phenotypic traits related to damage caused by heat and by assessing the degree of lipid peroxidation. The experiments have revealed important aspects of the role that some phenylpropanoids have in response to adverse environmental conditions in vivo.

Ruolo biologico dei fenilpropanoidi in colture cellulari di Daucus carota

TOFFALI, Ketti
2011

Abstract

Le piante producono molte migliaia di metaboliti secondari e fino ad oggi dal punto di vista chimico sono noti più di 40000 terpenoidi, 5000 alcaloidi e 20000 composti fenolici. Molti metaboliti secondari, tra cui i composti fenolici, sono stati ampiamente studiati per la loro attività biologica in sistemi animali, sia in vivo che in vitro, ma il ruolo della maggior parte di questi metaboliti nei sistemi vegetali non è ancora noto. È noto che molti stress biotici e abiotici che inducono la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) nelle cellule vegetali inducono anche l’accumulo di fenilpropanoidi, ma quanto realmente essi siano coinvolti nelle reazioni di scavenging dei ROS in vivo non è ancora chiaro. (Hernandez et al., 2009). Le colture in vitro di cellule vegetali sono ampiamente utilizzate come sistemi sperimentali per studiare molti aspetti fisiologici, biochimici e molecolari delle piante. La coltura cellulare R3M di carota è stata selezionata da una coltura non pigmentata per la capacità di produrre antocianine. L’imaging in vivo di singole cellule ha evidenziato che cellule pigmentate sono più resistenti delle cellule non pigmentate ad uno stress di tipo ossidativo. La caratterizzazione metabolica di estratti metanolici di cellule R3M mediante HPLC-DA e HPLC-MS mostra che la linea cellulare produce antociani, acidi idrossicinnamici e acidi idrossibenzoici. Inoltre, l'analisi del metaboloma delle cellule R3M in condizioni di aumentata agitazione mostra una correlazione positiva tra l'accumulo di antociani, di acidi idrossicinnamici e acidi idrossibenzoici. Lo scopo di questo lavoro è l’indagine del possibile ruolo biologico della presenza e della abbondanza relativa di alcuni fenilpropanoidi, in particolare delle antocianine, nella coltura cellulare R3M di carota. L'accumulo di antocianine in cellule R3M è stato incrementato mediante la somministrazione dei precursori biosintetici. L’analisi in HPLC-MS degli estratti metanolici delle cellule ha mostrato l’effetto dei feeding sul metaboloma della coltura e l’analisi statistica multivariata dei dati cromatografici ha permesso il confronto dei diversi trattamenti eseguiti. La diversa capacità delle cellule sottoposte a feeding di rispondere ad uno stress di tipo termico è stata monitorata mediante osservazione al microscopio ottico dei tratti fenotipici riconducibili a danni causati dal calore e mediante valutazione del grado di perossidazione lipidica. Gli esperimenti hanno messo in luce importanti aspetti del ruolo che alcuni fenilpropanoidi hanno in risposta a condizioni ambientali avverse in vivo.
Spettrometria di massa; antocianine; flavonoidi; stress termico; perossidazione lipidica; colture cellulari vegetali
Plants produce many thousands of secondary metabolites and to date from the chemical point of view more than 40,000 terpenoids, 5,000 alkaloids and 20,000 phenolic compounds are known. It is known that many biotic and abiotic stresses that induce the production of reactive oxygen species (ROS) in plant cells induce the accumulation of phenylpropanoids, but if they are really involved in the reactions of scavenging of ROS in vivo is still unclear (Hernandez et al., 2009). In vitro plant cell cultures are widely used as experimental systems for studying many physiological, biochemical and molecular features of plant. R3M carrot cell culture was selected from a non-pigmented culture for their ability to produce anthocyanins. Experiments of in vivo imaging of single cells showed that pigment cells are more resistant than non-pigmented ones to oxidative stress. The metabolic characterization of metanolic extracts of R3M cell cultures by HPLC-DA and HPLC-MS reveals that R3M cell line produces anthocyanins, hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acids. The aim of this doctoral project is an investigation of the possible biological role of the presence and relative abundance of some phenylpropanoids, particularly anthocyanins, in R3M cell culture. The accumulation of anthocyanins has been increased by feeding of biosynthetic precursors. The HPLC-MS analysis of cell methanol extracts has shown the effect of feeding on the R3M metabolic profile; comparison of the treatments has been performed by multivariate statistical analysis of the chromatographic data. The different ability of feeded cells to respond to thermal stress has been analyzed by microscopic observation of phenotypic traits related to damage caused by heat and by assessing the degree of lipid peroxidation. The experiments have revealed important aspects of the role that some phenylpropanoids have in response to adverse environmental conditions in vivo.
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