Investigations into Alzheimer's disease pathogenetic mechanisms using normal adult human astrocytes in culture

La malattia di Alzheimer è una delle principali patologie neurodegenerative legate alla terza età: i casi infatti che si sviluppano in età precoce rappresentano meno dell’1% e sono dovuti ad alterazioni geniche specifiche. L’eziologia di questa malattia resta ancora sconosciuta, sebbene la presenza di placche senili, composte principalmente di Aβ1-40 e Aβ1-42, o aggregati fibrillari intraneuronali della proteina tau, siano caratteristiche ormai note del suo stadio avanzato. Diversi processi patologici sono stati messi in relazione con il danno neuronale e il declino cognitivo tipici della malattia. Tra questi uno dei più studiati è il processo infiammatorio indotto da aggregati di amiloide negli spazi perineuronali e mediato principalmente da astrociti e cellule della microglia. Recentemente anche alterazioni dei meccanismi neurovascolari e della struttura della barriera emato-encefalica sono stati correlati con la progressione del processo patologico e con l’induzione locale di angiogenesi: la presenza di VEGF, una delle principali citochine ad azione angiogenica, è stata dimostrata infatti in corrispondenza di cluster di astrociti reattivi in pazienti AD. Per chiarire il possibile legame tra la neoangiogenesi, la presenza di aggregati di amiloide e la secrezione di mediatori infiammatori, si è deciso di analizzare la modulazione dell’espressione del complesso trascrizionale HIF-1α•HIF-1β in astrociti umani normali adulti (NAHA) a seguito del trattamento con la triade di citochine proinfiammatorie (CM-trio, IL-1β + IFN-γ + TNF-α) e con Aβ25-35, il frammento attivo dell’Aβ1-42. Il legame di HIF-1α•HIF-1β alla sequenza HRE presente nella regione promotoriale di geni correlati alla malattia, quali VEGF e BACE-1, è responsabile della loro induzione in risposta a stimoli quali stress ipossico. Entrambi i trattamenti, pur non alterando in nessun modo la trascrizione delle subunità HIF-1α e HIF-1β, inducono sia una maggiore stabilità della frazione proteica di entrambi i fattori, sia un’aumentata traslocazione del complesso a livello nucleare con conseguente legame alla sequenza HRE. Il trattamento invece con CM-trio determina una significativa riduzione dell’espressione di un altro fattore implicato nell’induzione della trascrizione del VEGF-A, PGC-1α, dimostrando che HIF-1α•HIF-1β è il solo complesso coinvolto nella modulazione del fattore angiogenico. La traslocazione nucleare dell’eterodimero HIF-1α•HIF-1β e il suo legame alla sequenza promotoriale HRE corrisponde ad un aumento dell’espressione di tre varianti di splicing del VEGF-A (121, 165 e 189), ma non all’ accumulo della corrispondente frazione proteica a livello intracellulare. Analisi mediante ELISA hanno dimostrato un aumento del rilascio del VEGF-A nel medium di coltura di cellule trattate con Aβ25-35, con la coppia IFN-γ + TNF-α, ma soprattutto con CM-trio. L’insieme di Aβ25-35 + CM-trio non è in grado di esercitare un’azione sinergica sul rilascio, dimostrando che la triade di citochine proinfiammatorie è il principale induttore della secrezione. Il complesso HIF-1α•HIF-1β si è rivelato inoltre implicato nella regolazione della trascrizione di BACE-1, una delle secretasi coinvolte nella produzione di Aβ. Il trattamento con Aβ25-35 stimola infatti la maggiore espressione dell’mRNA e della proteina BACE-1, inducendo inoltre un aumento della sua attività e di quella della γ-secretasi, altro enzima responsabile del processamento dell’APP. La produzione di peptidi Aβ in NAHA trattati con Aβ25-35 è stata dimostrata tramite immunoblotting e immunofluorescenza; quest’ultima tecnica, in particolare, ha permesso di evidenziare la presenza di aggregati di Aβ25-35 nel citoplasma di astrociti trattati, delineando un loro possibile ruolo nella rimozione di aggregati di amiloide potenzialmente patologici.

Alterations in neurovascular mechanisms and blood-brain barrier (BBB) disorders have been related to late-onset Alzheimer’s disease (AD). An increased expression of vascular endhotelial growth factor (VEGF) has seen in cluster of reactive astrocytes in AD brains and into rat hippocampus Aβ1-42 injected. We found that the Aβ25-35, an amyloid β1-42 active fragment, and proinflammatory cytokines (CM-trio, IL-1β + IFN-γ + TNF-α) treatments has induced an increased protein steady state levels of the hypoxia-inducible factor transcriptional complex (HIF-1α•HIF-1β) in normal adult human astrocytes (NAHAs). This transcription factor is the main regulator of the VEGF expression, but also the PGC-1α cofactor seems to be related to its upregulation in AD. We analyzed the mRNA expression of both these factors, but only the complex HIF-1α•HIF-1β was implicated in the VEGF-A expression. Indeed, the enhanced HIF-1α•HIF-1β nuclear translocation and its binding at the hypoxia response element (HRE) sequence in the VEGF-A promoter, found after both treatments, were correlated with the increased VEGF-A mRNA splice variants (121, 165, and 189) expression. The CM-trio was the most powerful stimulus inducing the VEGF-A secretion in NAHAs culture medium, also induced, less than CM-trio, by the paired cytokines IFN-γ + TNF-α, Aβ25-35 and CM-trio + Aβ25-35 treatments. Hence the astrocytes in an AD brain can produce a raised amount of VEGF-A in response to Aβ peptide and the proinflammatory cytokines promoting the neoangiogenic process. We found that the HIF-1α•HIF-1β complex was furthermore responsible for the β-secretase (BACE-1) mRNA and protein up-regulation in our experimental model treated with Aβ25-35. After the same treatment we found moreover an enhancement of the β and γ-secretase activities, the two secretases involved in the amyloid precursor protein (APP) processing. The immunofluorescence and immunoblotting assays confirmed the Aβ production in NAHAs, suggesting the existence of a positive feed-back loop for the Aβ synthesis in astrocytes. This findings support the theory that astrocytes, as well as neurones, are involved in the AD decline of cognitive functions. Moreover, the immunofluorescence assay shows the Aβ25-35 uptake, defining a possible role of astocytes as Aβ peptides scavengers.