A proteomic approach to the study of human thoracic aorta aneurysms

Le patologie cardiovascolari rappresentano la principale causa di malattia e morte: solo negli Stati Uniti si stima che 62 milioni circa di persone siano affette da tali patologie e nel 2000, 946,000 decessi sono stati attribuiti a patologie cardiovascolari, un ammontare pari al 39% delle cause di morte a livello mondiale. Anche gli aneurismi dell’aorta toracica (TAA) rientrano tra le malattie cardiovascolari che sono cause di decesso. Tra le varie tipologie di TAA, i meno caratterizzati e definiti da un punto di vista eziopatologico sono gli aneurismi non sindromici, familiari e non. La mia tesi si colloca proprio in questo ambito e la ricerca da me svolta ha avuto lo scopo di approfondire le conoscenze degli aspetti morfologici e dei meccanismi molecolari sottostanti agli aneurismi non sindromici non familiari (NSTAA). In particolare, in collaborazione con la Sezione di Cardiochirurgia dell’Università di Verona ho selezionato nove campioni di tunica media provenienti da pazienti affetti da NSTAA e nove controlli di riferimento da analizzare mediante un approccio proteomico-bioinformatico, cui è seguita un’analisi mediante immunoblotting, istologia quantitativa (QH), e immunoistochimica (ICH)/immunofluorescenza (IF). La prima caratteristica che ho osservato nella tunica media degli NSTAA rispetto ai controlli è stata una profonda disorganizzazione a livello della matrice extracellulare (ECM). Ho infatti rilevato anomalie nelle reti di fibre elastiche accompagnate da un aumento della quantità delle fibre collagene. Inoltre, ho riscontrato una diminuzione del numero delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) conseguente a un aumento dell’attività della proapoptotica Caspasi-3. Nei medesimi campioni è aumentata in modo significativo anche l’espressione delle due isoforme della cistationina gamma-liasi (CTH), la cui attività enzimatica potrebbe determinare un incremento della concentrazione di H2S nei tessuti oltre i livelli fisiologici, ed essere perciò almeno in parte responsabile sia dell’apoptosi che della diminuzione dell’attività proliferativa delle VSMC. Le analisi morfologiche da me condotte hanno permesso di evidenziare cambiamenti significativi del fenotipo delle VSMC che da contrattile è divenuto prevalentemente sintetico/secretorio. Esaminando le proteine solubili della ECM e le proteine coinvolte nei processi di adesione tra cellule ed ECM, ho riscontrato un aumento dell’espressione della Paxillina (PXN), nella sua forma intera e proteolizzata, e del proteoglicano Testican-2. Viceversa, l’espressione della microfibrillar-associated glycoprotein-1 (MAGP-1) era diminuita. Profonde alterazioni hanno interessato anche il citoscheletro, in cui l’espressione di una proteina caratteristica dei filamenti intermedi, la Vimentina (VIM) risulta diminuita in modo considerevole. Infine, ho riscontrato che rispetto ai controlli negli NSTAA, due importanti vie segnaletiche: Jagged1/Notch1 ed EDA/EDAR presentano modificazioni significative. La prima vede un aumento di espressione della forma intera di Jagged1 (JAG1) e del suo recettore Notch1. Tuttavia, tale signaling è contrastato dall’accumulo del frammento extracellulare solubile di JAG1. Nella seconda via, si verifica un incremento dell’espressione dell’ ectodisplasina (EDA), cui però si accompagna una diminuita espressione del recettore corrispondente (EDAR). In conclusione, la mia ricerca, basata sull’utilizzo di un approccio proteomico ed istologico funzionale, mi ha permesso di evidenziare diverse cause dell’indebolimento della parete aortica nei NSTAA, come uno squilibrio tra la componente elastica e quella fibrosa, una perturbazione dell’equilibrio tra la frazione proliferativa e la morte cellulare delle VSMC, profonde alterazioni di componenti della ECM, citoscheletro e di più vie cellulari segnaletiche. Tutte queste modificazioni concorrono alla progressione della patologia aneurismatica.

Cardiovascular disease is the leading cause of illness and death in the whole world. In the United States, for example, there are an estimated 62 million people with cardiovascular disease. In 2000, approximately 946,000 deaths were attributed to cardiovascular disease, accounting for 39% of all deaths in the USA. Among these causes of death thoracic aorta aneurysms (TAAs) can be found. Both familial and nonfamilial nonsyndromic thoracic aortic aneurysms (NSTAAs) are less well characterized than syndromic ones. This is the aim of my thesis: increasing our knowledge about the specific morphological and molecular characteristics that underlie NSTAAs. Tunica media samples taken from nine selected nonfamilial NSTAAs and nine reference patients were investigated via proteomics-bioinformatics, immunoblotting, quantitative histology (QH), and immunohistochemistry (IHC)/immunofluorescence (IF). The first characteristic I observed is a deep disorganization at extracellular matrix (ECM) level. I found a distorted elastic fiber network partnered with an increase in collagen fibers. The vascular smooth cells (VSMCs) decreased in number due to a proapoptotic increase in Caspase-3 activity. In the same media samples cystathionine gamma-lyase (CTH) was diffusely upregulated, and by producing H2S might be responsible for both the apoptosis and a hindered cell proliferation. VSMCs presented even a change in their phenotype, switching from a contractile to synthetic/secretory one. At the ECM level I found an increase in Paxillin (PXN) holoprotein, and in its cleaved form. Expression of the Testican-2 proteoglycan was also boosted. Conversely, the microfibrillar-associated glycoprotein-1 (MAGP-1) was found decreased. Alterations at the cytoskeletal level were also present; in fact there was a significant down-regulation in Vimentin (VIM) expression. Moreover, I found deeply altered even two important cell signaling systems in NSTAAs. On the one hand, an upregulation of Jagged1 (JAG1) holoprotein and its receptor, Notch1, whose signal was hindered by an accumulation of extracellular soluble JAG1 fragments. On the other hand, I observed an upregulated ectodysplasin (EDA) protein combined with a downregulation of its receptor (EDAR). In conclusion, I found a weakening of the aortic wall caused by an imbalance between elastic and fibrosis components in NSTAAs. This imbalance is coupled with a perturbed ratio between dying and proliferating cell fractions. In NSTAAs I found even deep alterations in ECM, cytoskeleton, and cell signaling. All together these changes concur to aneurysm progression.