Mutation search and association study of candidate genes in non melanoma skin cancer after organ transplantation

La Prostaglandina E2 (PGE2) è coinvolta in diversi processi fisiopatologici. PGE2 è una molecola chiave nel processo di cancerogenesi, essendo coinvolta nella proliferazione cellulare, nell'angiogenesi, nella sorveglianza immunitaria e nell’apoptosi. La sintesi di PGE2 richiede tre enzimi che agiscono in sequenza: la Fosfolipasi A2, la cicloossigenasi e la sintetasi della prostaglandina E. La Fosfolipasi A2 (PLA2) permette il rilascio di acido arachidonico (AA) dai fosfolipidi di membrana, la cicloossigenasi (COX) converte l’AA a PGH2, che viene isomerizzato a PGE2 dalla sintasi della prostaglandina E (PGES). PGE2 viene rilasciato dalle cellule e interagisce con quattro distinti recettori, EP1, EP2, EP3 e EP4. Una sovra-espressione della forma inducibile di COX (Cox-2) e di PGES microsomiale-1 (mPGES-1), con conseguente eccessiva produzione di PGE2, è stata osservata in vari tessuti tumorali, tra cui alcuni tumori cutanei. Una sovra-espressione di EP1 è stata osservata in tumori cutanei indotti da UVB. Varianti genetiche, situate nella regione del promotore dei geni codificanti per la prostaglandina sintasi-2 (PTGS2/COX2), PGES microsomiale-1 (mPGES-1), o per il recettore EP1 (PTGER1), potrebbero determinare alterazioni nella espressione genica, con una conseguente aumentata sintesi di PGE2 o alterata risposta a PGE2. Tali varianti potrebbero pertanto rappresentare fattori di rischio per lo sviluppo di tumore cutaneo non melanoma (non melanoma skin cancer NMSC) in individui riceventi trapianto d’organo (OTRs). Per determinare se polimorfismi in questi geni potessero costituire utili marcatori genetici di suscettibilità, contribuendo alla individuazione precoce di individui a maggiore rischio di NMSC, è stato eseguito uno studio caso-controllo. Due polimorfismi nel gene PTGS2, tre nel gene mPGES-1 e tre nel gene PTGER1 sono stati genotipizzati in 286 OTRs, 144 casi NMSC e 142 controlli. L’allele –765G del gene PTGS2 è significativamente più frequente nei casi rispetto ai controlli [p=0.015; OR=9.59 (1.36-192.66)], suggerendo che questa variante possa rappresentare un fattore di rischio per lo sviluppo di tumori basocellulari (BCC) nei soggetti sottoposti a trapianto prima dei 50 anni. L’analisi dei polimorfismi –1760C>A (rs3810254), -1728G>A (rs3810255) e –1113C>T (rs2241359) della regione 5' prossimale del gene PTGER1 ha dimostrato che gli alleli minori per queste varianti erano più rappresentati in individui con tumore squamocellulare (SCC), rispetto ai corrispondenti controlli sottoposti a trapianto prima dei 50 anni, ma la differenza non è risultata statisticamente significativa. Per verificare se una regione di 1452 pb del 5' fiancheggiante il gene, e contenente i tre polimorfismi, esercitasse un'attività di promotore, è stata eseguita l’analisi funzionale in colture cellulari HeLa e HaCat (cheratinociti umani). Nonostante una debole attività di promotore sia stata osservata in cellule HeLa, non siamo stati in grado di dimostrare attività di promotore nelle cellule HaCat, anche dopo stimolazione con LPS. La regione del 5' fiancheggiante il gene mPGES-1 è stata analizzata mediante l’analisi degli eteroduplici per identificare nuove varianti. Tre polimorfismi, situati all'interno di regioni conservate del gene e riportati nel database NCBI come –664T>A (rs7873087), –663A>T (rs7859349) e –439T>C (rs7872802), sono stati identificati. Le distribuzioni genotipiche osservate hanno indicato completo linkage disequilibrium per i tre polimorfismi, e nessuna associazione con NMSC. In conclusione, l’allele -765C nel gene PTGS2 sembra rappresentare un fattore protettivo verso lo sviluppo di BCC negli individui sottoposti a trapianto prima dei 50 anni. L’analisi dei polimorfismi nella regione 5’ fiancheggiante i geni mPGES-1 e PTGER1 tende ad escludere l’ipotesi che varianti in queste regioni possano rappresentare fattori di rischio per la predisposizione a NMSC.

Prostaglandin E2 (PGE2) is a prostanoid with a variety of bioactivities, and has been implicated in various pathologies. PGE2 appears as a key molecule in tumour formation, involved in cell proliferation, angiogenesis, immune surveillance, and apoptosis. PGE2 is produced via three sequential enzymatic reactions: release of arachidonic acid (AA) from membrane glycerophospholipids by phospholipase A2 (PLA2), conversion of AA to the unstable intermediate prostanoid PGH2 by cyclooxygenase (COX), and isomerization of PGH2 to PGE2 by prostaglandin E synthase (PGES). PGE2 is released from cells and it interacts with four distinct receptors, EP1, EP2, EP3, and EP4. Over-expression of the inducible form of COX (Cox-2) and microsomal-prostaglandin E synthase-1 (mPGES-1), resulting in excessive prostaglandin E 2 (PGE2) production, has been observed in cancer of various tissues, including skin cancer. An over-expression of EP1 has been observed in skin cancer development induced by UVB. Alteration in gene expression, due to genetic variants located in the promoter region of the genes for prostaglandin synthase-2 (PTGS2/COX2), microsomal prostaglandin E synthase (mPGES-1), or prostaglandin E receptor 1 (PTGER1) may result in augmented PGE2 synthesis or in altered response to PGE2, and could represent risk factors for the development of non melanoma skin cancer (NMSC) in organ transplant recipients (OTRs). To determine if polymorphisms in these genes can be useful genetic markers of susceptibility that may contribute to early detection of individuals at greater risk of NMSC, a case-control study was performed. Two polymorphisms in the PTGS2 gene, three in the mPGES-1 gene, and three in the PTGER1 gene were genotyped in 286 OTRs, 144 NMSC cases and 142 controls. Allele –765G in the PTGS2 gene was more frequent in cases than in controls [p=0.015, OR=9.59 (1.36-192.66)], suggesting that this variant might represented a risk factor in the development of basal cell cancer (BCC) in individuals undergoing transplantation before 50 years of age. Analysis of polymorphisms –1760C>A (rs3810254), -1728G>A (rs3810255), and –1113C>T (rs2241359) in the 5’ proximal region of the PTGER1 gene showed that minor alleles of these variants were more represented in individuals with squamous cell cancer (SCC), when compared to matched controls who underwent transplantation before 50 years of age, but the difference did not reach significance. To verify if the 1452 bp fragment of the 5’ flanking region, which contains the three polymorphisms could exert promoter activity, we performed functional analysis in HeLa and HaCat cultured cells. Although a weak promoter activity was observed in HeLa cells, we were unable to demonstrate any promoter activity in HaCat cells, even after LPS stimulation. The 5’ flanking region of the mPGES-1 gene was screened by heteroduplex analysis to identify new variants. Three polymorphisms, located within conserved regions of the gene, and reported in NCBI databases as –664T>A (rs7873087), –663A>T (rs7859349) and –439T>C (rs7872802), were identified. The observed genotype distributions indicated complete linkage disequilibrium for the three polymorphisms, and no association with NMSC was observed. In conclusion, allele –765C in the PTGS2 gene seems to represent a protection factor against the development of BCC tumours in individuals undergoing transplantation before 50 years of age. Analysis of polymorphisms in the 5’ regions of the mPGES-1 and PTGER1 genes did not support the hypothesis that variants in these regions could play a major role in NMSC predisposition.