Horizontal gene transfer in the marine environment: non pathogenic vibrio strains carrying virulence and antibiotic resistant genes and constituting a potential risk for human health

Ceppi batterici ambientali appartenenti a specie non patogene di Vibrio vengono considerati come privi di patogenicità potenziale e non in grado di provocare malattie infettive. Negli ultimi anni, tuttavia, una serie di casi di infezione dovuti a vibrioni non patogeni sono stati riportati in Europa. Per questo motivo e per studi pubblicati che affermano che i batteri non patogeni presentano un certo numero di geni di virulenza e che il trasferimento genetico orizzontale può avvenire in ambiente acquatico la valutazione di questi microrganismi sta cambiando. Ora anche i vibrioni considerati non patogeni possono rappresentare un potenziale rischio per la salute pubblica. Numerosi studi indicano che i geni coinvolti nella patogenicità, nella fitness ecologica e nella resistenza agli antibiotici possono essere mobilizzati in elementi extra-cromosomici o in isole di patogenicità portando così ad una ricombinazione e ad un mescolamento del materiale genetico, originando nuovi ceppi con un aumentata fitness e un maggiore potenziale virulento. Il trasferimento genico orizzontale (HGT) e l'acquisizione di DNA estraneo è un processo fondamentale per l'evoluzione della maggior parte delle specie batteriche. In questo studio, una collezione di ceppi di Vibrioni marini isolati nella zona dell' Mar Adriatico è stata testata per la presenza di geni di virulenza, fitness e antibiotico resistenza di solito presenti in ceppi patogeni di V. cholerae e V. parahaemolyticus . A tal fine, una collezione di ceppi ambientali appartenenti a specie non patogene di Vibrio quali V. alginolyticus, V. harveyi, V.mimicus e molti altri, è stata ottenuta da campioni di acqua marina, plancton e sedimenti prelevati in una serie di località costiere , principalmente in corrispondenza delle foci dei fiumi. Per valutare l'incidenza di ceppi resistenti agli antibiotici, i campioni sono stati ottenuti anche in diverse aziende di allevamento ittico, nella zona indicata, in quanto rappresentano nicchie ecologiche ristrette, sotto la pressione selettiva causata dall'uso di antibiotici per il trattamento di malattie nei pesci. Tra i ceppi derivati da campioni marini (acqua, plancton e sedimenti), il 20% presenta geni di fitness e il 10% fattori di virulenza. Un certo numero di ceppi presentano più di un gene di virulenza o di fitness e alcuni li presentano contemporaneamente. Globalmente, la percentuale di ceppi che portano geni di virulenza e / o di fitness nei campioni marini è del 28%. Quando vengono cosiderati nella stima percentuale anche i campioni provenienti da allevamenti ittici si nota un aumento significativo nelle percentuali infatti il 64% dei ceppi porta geni di fitness, il 29% geni di virulenza e il 74% geni di fitness e o di virulenza. Alcuni dei geni individuati nei ceppi marini non patogeni di Vibrio qui esaminati, sono fattori di virulenza classici di vibrioni patogeni quali il V. colera (gene che codifica per la neuraminidasi) o di V. parahaemolyticus (Tdh, Trh e geni coinvolti nel sistema di secrezione). Anche i geni di fitness possono avere un ruolo importante nella virulenza in quanto sono implicati nella persistenza dei batteri in un ambiente specifico, facilitando in tal modo un eventuale contatto con un ospite appropriato. In questo studio, è stata rilevata un'alta incidenza di geni coinvolti nei meccanismi di sopravvivenza in ambiente naturale, quali: la formazione di biofilm, la sintesi di flagelli che mediano la motilità e la possibilità di sopravvivere attraverso l'associazione simbiotica con gli altri organismi marini. La comparsa di batteri resistenti agli antibiotici in ambiente è un problema per la salute pubblica ed è dovuto ad un massiccio uso di agenti antimicrobici nel settore dell'acquacoltura per prevenire e curare le malattie nei pesci e crostacei. Gli antibiotici e batteri antibiotico-resistenti possono persistere nell'ambiente acquatico anche per diversi mesi dopo la loro somministrazione. Il rischio per la salute umana è quindi dovuto ad una azione diretta del antibiotico, ma anche all'infezione dell'ospite umano con batteri resistenti agli antibiotici presenti nei prodotti di ittici e nell’acqua . Questo è il primo studio che valuta l'incidenza di geni di resistenza ai chinoloni in vibrioni direttamente isolato dall'ambiente marino. Dei 156 ceppi esaminati, 13 ceppi (8%) hanno riportato almeno un gene coinvolto nella resistenza ai chinoloni. I geni di resistenza ai chinoloni sono stati i più frequentemente rilevati in questi ceppi, sei ceppi portano qnrA, 3 ceppi qnrS, e uno qnrD. I Ceppi NPV42 e NPV44 presentano contemporaneamente i geni qnrA e qnrS. Altri quattro ceppi ambientali hanno inoltre evidenziato la presenza del gene qepA mentre uno solo portato il gene aac(6 ')-Ib-cr. Il gene qnrC non è stato ritrovato in nessuno dei ceppi analizzati. È interessante notare che molti dei geni individuati nei ceppi marini di Vibrio erano situatì in elementi genetici mobili come integroni e isole di patogenicità, i quali sono in grado di catturare diversi tipi di geni. Dei 28 ceppi che presentano l’integrasi associata all’integrone di classe 1, alcuni sono stai testai per verificare la presenza dell’intero integrone. 8 ceppi hanno integroni di varie dimensioni. Due di questi isolati portano all’interno dell’integrone due cassette di geni coinvolti nella resistenza al cloramfenicolo all’amikacina anche se solo uno dei ceppi la esprime. Nessuno dei nostri ceppi è risultato positivo alla ricerca di elementi integrativi di coniugazione. Di interesse particolare è la presenza in alcuni dei nostri ceppi di geni che si trovano all’interno di isole di patogenicità originariamente descritte in V. colera (VPI-2) e V. parahaemolyticus (Vp-PAI). I dati raccolti in questo studio supportano la tesi secondo la quale i ceppi non patogeni fungono da serbatoio di geni di virulenza e antibiotico resistenza e confermano che vi è lo scambio di materiale genetico (DNA) in ambiente marino. Tale scambio può verificarsi tra i batteri marini autoctoni, ma anche tra i membri della microflora marina e agenti patogeni umani, attraverso attività antropiche ambientalio La comparsa di batteri patogeni umani con rinnovata virulenza e / o caratteristiche di resistenza agli antibiotici è un problema per la salute pubblica e un rischio per la salute umana.

Environmental bacterial strains belonging to non pathogenic Vibrio species have been considered as deprived of pathogenic potential and not able of causing infectious diseases. In recent years, however, a series of infection cases due to non pathogenic vibrios have been reported in persons swimming in European areas. Moreover, indications that horizontal gene transfer may occur in the aquatic environment and few reports on the presence of a number of virulence genes in non pathogenic bacteria, is changing the vision of these microorganisms as potential risk for public health. A number of studies indicate that genes involved in pathogenicity, ecological fitness and antibiotic resistance can be mobilized in extra-chromosomal elements or in pathogenicity islands thus having the possibility of mix or recombine in the aquatic environment and to originate new strains with increased fitness and virulence potential. Horizontal gene transfer (HGT) and the acquisition of foreign DNA is a fundamental process in the evolution of most bacterial species. In this study, a collection of marine Vibrio strains isolated in the area of the North Adriatic Sea was screened for the presence of virulence, fitness genes and antibiotic (AR) resistance traits usually present in V. cholerae and V. parahaemolyticus pathogenic strains. To this end, a collection of environmental strains belonging to non pathogenic Vibrio species such as V. alginolyticus, V. harveyi, V. mimicus and many others, was obtained from marine samples of water, plankton and sediments withdrawn in a series of coastal sites, mainly in correspondence to the riverine mouths. To evaluate the incidence of antibiotic resistant strains, samples were also obtained in different fish farms in the described area, as they represent restricted ecological niches under the selective pressure caused by the use of antibiotics to treat fish outbreaks. Among strains derived from marine (water, plankton and sediment) samples, 20% carried fitness genes and 10% virulence determinants. A number of strains carried more than one virulence or fitness genes and some carried contemporary genes involved in pathogenicity and in ecological fitness. Globally, the percentage of strains carrying virulence and/or fitness genes in the marine samples was 28%. The percentages of strains showing the specific genes varied significantly when fish farm samples are considered: 64% of the strains carried fitness genes and 29% of the isolates carried virulence genes Taken all together, strains carrying virulence and/or fitness genes in samples from aquaculture were 74%. Some of the genes detected in the marine non pathogenic Vibrio strains here examined are classical virulence factors of human pathogenic Vibrio species such as V. cholera (neuraminidase-encoding gene) or V. parahaemolyticus (tdh, trh, secretion system genes). Also fitness genes have an important role in virulence in that they are involved in the persistence of bacteria in a specific environment thus facilitating a possible contact with an appropriate host. In this study, it has been demonstrated a high incidence of genes involved in important mechanisms of survival in the natural environment; among these, the formation of a biofilm, the synthesis of flagella mediating motility and the possibility of surviving via the symbiotic association with other marine organisms. The emergence of antibiotic resistant bacteria in the environment is a public health concern due to a largely use of antimicrobial agents in aquaculture to prevent and treat diseases in fish and shellfish. Antibiotics and antibiotic-resistant bacteria can persist in the aquatic environment also for several months after their administration. The risk for human health is then due to a direct action of the antibiotic but also to the infection of the human host with antibiotic resistant bacteria present in water and fish products. To the best of our knowledge, this is the first study which evaluates the incidence of quinolone resistance genes in vibrios directly isolated from the marine environment. Of the 156 strains examined, 13 strains (8%) resulted to carry at least one gene involved in quinolone resistance. Genes qnr were the most frequently present in these strains with six strains carrying qnrA, 3 strains with qnrS, and one presenting qnrD. Strains NPV42 and NPV44 carried contemporary genes qnrA and qnrS. Other four environmental strains showed the presence of the gene qepA while only one carried the aac(6’)-Ib-cr gene. The gene qnrC was not detected at all. Interestingly, many of the genes detected in the marine Vibrio strains were located in mobile genetic elements such as integrons and pathogenicity islands, known elements capturing different types of genes. Of the 28 strains showing to carry the integrase associated to the class 1 integron, some demonstrated to bear integrons of different sizes. Two of these isolates carried in the integron two cassettes involved in chloramphenicol and in amikacin resistance although only one of the strains expressed antibiotic resistance. None of the environmental strains resulted positive to the search for integrative conjugative elements. Particularly interesting the presence, in a number of strains, of multiple virulence genes located in pathogenicity islands originally described in V. cholerae and V. parahaemolyticus. As an example, the strains carrying the VPI-2 with the virulence gene nanH and fragments of the V. parahaemolyticus Vp-PAI including genes belonging to secretion systems and the tdh. Data collected in this study clearly support the vision of non pathogenic Vibrio strains as a significant reservoir of virulence and antibiotic resistance genes and confirm that exchange of DNA material occurs among bacteria in the aquatic environment. The exchange of this genetic material can occurs among marine autochthonous bacteria but also among members of the marine microflora and human pathogens reversed, via anthropogenic activities, in the aquatic environment. The emergence of human bacterial pathogens with new virulence and /or antibiotic resistance traits is a direct concern for public health and a risk for human health.