ROLE OF THE MUCIN P-SELECTIN GLYCOPROTEIN LIGAND-1 IN THE CONTROL OF IMMUNE SUPPRESSION EXERTED BY REGULATORY T CELLS

La mucina P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) lega le selectine L-, E- e P-selectin e controlla il traffico leucocitario in condizioni fisiologiche e patologiche. Il ruolo di PSGL-1 nell’induzione e nello sviluppo di malattie autoimmuni non è chiaro, ma PSGL-1 sembra essere importante nell’omeostasi immunologia dei linfociti T. In questo progetto di Dottorato abbiamo analizzato il ruolo della mucina PSGL-1 nell’induzione dell’encefalomielite sperimentale autoimmune (EAE), una patologia infiammatoria autoimmune a carico del sistema nervoso centrale (SNC), utilizzata come modello sperimentale della sclerosi multipla umana. Partendo dall’osservazione che l’induzione attiva di EAE con il peptide mielinico myelin olygodendrocyte glycoprotein (MOG)35-55 in animali PSGL-1-/- porta ad una malattia più grave rispetto a quella sviluppata da topi WT (wild-type), abbiamo ipotizzato un ruolo del PSGL-1 in meccanismi regolatori coinvolti nello sviluppo della malattia. Questa ipotesi è inoltre accompagnata dal fatto che, in un modello passivo di EAE, cellule T encefalitogeniche MOG35-55-specifiche prodotte da animali PSGL-1-/- inducono una malattia più severa rispetto a cellule encefalitogeniche WT. La nostra attenzione si è rivolta in particolare verso le cellule T regolatorie CD4+CD25+Foxp3+ (Tregs), che regolano l’insorgenza di risposte infiammatorie autoimmuni e sono essenziali per limitare la gravità dell’EAE. In un modello attivo di EAE, abbiamo dimostrato che cellule Tregs deficienti in PSGL-1, iniettate al giorno +7 post-immunizzazione (fase pre-clinica), non sono in grado di sopprimere lo sviluppo dell’EAE, rispetto a Tregs WT. Inoltre, saggi di proliferazione in vitro hanno evidenziato una ridotta capacità delle Tregs deficienti in PSGL-1 di inibire la proliferazione di linfociti T CD4+CD25-. Partendo da tali osservazioni, abbiamo ipotizzato che la mancanza di PSGL-1 sulle cellule Tregs abbia un doppio effetto sulla loro funzionalità, nella fase pre-clinica di malattia: 1. un possibile deficit nel traffico delle Tregs all’interno del SNC infiammato in corso di malattia; 2. un blocco della capacità delle Tregs di sopprimere in vivo l’attivazione dei linfociti T encefalitogenici all’interno dei linfonodi drenanti di topi immunizzati per EAE. In base a tali ipotesi, abbiamo sviluppato il nostro progetto con due obiettivi: OBIETTIVO 1: ANALISI DEL TRAFFICO DELLE Tregs NEL SNC IN CORSO DI EAE. Utilizzando tecniche di microscopia intravitale abbiamo dimostrato che cellule Tregs deficienti in PSGL-1 sono sostanzialmente incapaci di interagire con vasi piali cerebrali infiammati. Saggi di migrazione in vivo nel SNC infiammato hanno mostrato che le cellule T regolatorie migrano all’interno del SNC preferenzialmente nella fase pre-clinica di malattia (giorno +7 post-immunizzazione), rispetto al picco di malattia (giorno +14 post-immunizzazione). Inoltre, abbiamo osservato che cellule Tregs PSGL-1-/- sono incapaci di migrare all’interno del SNC infiammato nella fase pre-clinica di malattia (giorno +7 post-immunizzazione), rispetto a cellule Tregs WT. I nostri risultati dimostrano inoltre che la mucina PSGL-1 è funzionalmente attiva sulla superficie di Tregs naïve, al contrario dei linfociti CD4+CD25- naïve, suggerendo un ruolo essenziale per questa molecola nel traffico e nell’omeostasi delle cellule T regolatorie all’interno del sistema immunitario. IPOTESI 2: ANALISI DELLA AZIONE SOPPRESSORIA DELLE Tregs SULL’ATTIVAZIONE DELLE CELLULE T ANTIGENE-SPECIFICHE NEI LINFONODI DRENANTI DI TOPI CON EAE. Utilizzando la tecnica della microscopia laser multi-fotonica, abbiamo studiato il comportamento di cellule MOG35-55-specifiche all’interno dei linfonodi drenanti di animali immunizzati, in presenza o assenza di Tregs WT o PSGL-1-/- esogene. In particolare, l’analisi è stata suddivisa in due fasi distinte: una fase pre-clinica “precoce” (giorno +1 post-immunizzazione) ed una fase pre-clinica “tardiva” (giorno +7 post-immunizzazione) di malattia. Come precedentemente descritto in letteratura, al giorno +1 post-immunizzazione la presenza di Tregs WT causa un aumento della motilità ed una diminuzione del coefficiente di arresto dei linfociti T MOG35-55-specifici, a causa di una riduzione dei tempi di contatto con le cellule dendritiche presentanti l’antigene. In questa fase precoce, le cellule Tregs PSGL-1-/- sono pienamente efficienti nel modulare la motilità dei linfociti T encefalitogenici. Al contrario, al giorno +7 post-immunizzazione le Tregs deficienti in PSGL-1 non sono in grado di modulare motilità e proliferazione dei linfociti MOG35-55-specifici, mentre le Tregs WT, come al giorno +1, influenzano notevolmente il comportamento dei linfociti T encefalitogenici. In conclusione, i nostri dati suggeriscono un ruolo chiave per la mucina PSGL-1 nel reclutamento delle cellule Tregs all’interno del SNC infiammato durante la fase pre-clinica dell’EAE; l’espressione di PSGL-1 sulle Tregs sembra inoltre essere essenziale per una efficiente soppressione dell’attivazione dei linfociti T encefalitogenici all’interno dei linfonodi drenanti nella fase pre-clinica “tardiva” di malattia. Globalmente, questi risultati dimostrano un ruolo chiave di PSGL-1 nella funzionalità delle Tregs in un modello di malattia cronica autoimmune.

Mucin P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) binds L-, E- and P-selectin and controls leukocyte trafficking under physiological and pathological conditions. Whereas PSGL-1 role is emerging in T cell homeostasis, its involvement in the induction of autoimmune diseases is not clear. In this PhD project, we studied the role of the mucin PSGL-1 in the induction and development of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), an autoimmune and inflammatory pathology of the central nervous system (CNS), used as experimental model for human multiple sclerosis. Here we show that active EAE induced with myelin olygodendrocyte glycoprotein (MOG)35-55 peptide was more severe in PSGL-1-/- mice, compared to WT (wild-type) animals. In addition, MOG35-55-specific T cells produced from PSGL-1 deficient mice transferred a significantly more severe disease than WT cells in a passive-transfer model of EAE, suggesting a role for PSGL-1 in regulatory mechanisms during EAE. In particular, we focused our attention on CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T (Treg) cells, which are known to regulate autoimmune pathologies development and are crucial in controlling EAE severity. We found that PSGL-1 deficient Tregs, compared to WT Tregs, were not able to suppress EAE when injected in the pre-clinical phase of the disease (day +7 post-immunization). Moreover, in vitro proliferation assays shown that PSGL-1-/- Tregs have a reduced ability to suppress CD4+CD25- T cells proliferation. These results suggested us a dual effect of PSGL-1 deficiency on Treg functionality in the pre-clinical phase of EAE: 1. a possible deficit in Treg trafficking into the inflamed CNS during EAE development; 2. a reduced suppression by Tregs of in vivo encephalitogenic T cells activation in draining lymph nodes of EAE mice. Based on these hypotheses, we developed our project with two aims: AIM 1: ANALYSIS OF Treg TRAFFICKING IN THE CNS DURING EAE. Intravital microscopy experiments showed that PSGL-1 deficient Tregs display a dramatic decrease of adhesive interactions in inflamed brain pial vessels, compared to WT Tregs. By performing in vivo migration assays in the inflamed CNS, we observed that regulatory T cells preferentially migrate in the CNS in the pre-clinical phase of the disease (day +7 post-immunization), compared to the disease peak (day +14 post-immunization), and Tregs from PSGL-1-/- mice present a strongly reduced migration capacity into the inflamed CNS in the pre-clinical phase of EAE, when compared to WT Tregs. Our results also demonstrated that PSGL-1 is functionally active on naïve Tregs, compared to naïve CD4+CD25- T cells, suggesting a crucial role for PSGL-1 in Treg homeostasis and trafficking in the immune system. AIM 2: ANALYSIS OF Treg-MEDIATED SUPPRESSION OF ANTIGEN-SPECIFIC T CELL ACTIVATION IN DRAINING LYMPH NODES OF EAE MICE. By using two-photon laser microscopy, we studied MOG35-55-specific T cell behaviour in draining lymph nodes of EAE mice, in the presence or absence of exogenous WT or PSGL-1-/- Tregs. We analyzed two different time points: an “early” pre-clinical phase of EAE (day +1 post-immunization) and a “late” pre-clinical phase of EAE (day +7 post-immunization). In the early pre-clinical phase of EAE (day +1 post-immunization), as previously shown, we found that MOG35-55-specific T cells showed a significant increase in their motility and decrease of the arrest coefficient in the presence of WT Tregs in draining lymph nodes of EAE mice, due to reduced contact times with antigen-presenting dendritic cells. At this time point, also PSGL-1 deficient Tregs efficiently modulated encephalitogenic T cells behaviour. On the contrary, PSGL-1-/- Tregs failed to modulate the motility behaviour and proliferation of MOG35-55-specific T cells during the late (day +7 post-immunization) pre-clinical phase of the disease, while exogenous WT Tregs still affect MOG35-55-specific T cells motility. In conclusion, our data demonstrate that PSGL-1 has a key role in CD4+CD25+Foxp3+ Treg migration in the CNS during the pre-clinical phase of EAE; moreover, PSGL-1 expression is necessary for an efficient suppression of late antigen-dependent T cell activation exerted by Tregs in the draining lymph nodes of EAE mice. Overall, our results demonstrate a previously unknown key role for PSGL-1 in Treg functionality in a model of autoimmune disease.