Application of tissue microarray technique in the evaluation of chromosomal abnormalities of clear cell renal cell carcinoma

Background Il carcinoma renale rappresenta il 3% di tutte le neoplasie dell’età adulta. Più del 40 % dei pazienti muore per questa neoplasia e la variante istologica più rappresentata é il carcinoma renale a cellule chiare (CRCC). Lo sviluppo e la progressione del CRCC sono determinati da alterazioni genetiche. Tra i geni potenzialmente coinvolti si annovera il gene di von Hippel-Lindau localizzato sul cromosoma 3p, la cui delezione costituisce la principale alterazione genetica nei CRCC e ne rappresenta uno degli eventi precoci nella trasformazione neoplastica. Solo pochi studi prendono in considerazione la perdita del 3p come potenziale indicatore prognostico. La validazione dei marcatori prognostici su molteplici campioni clinici è stata finora realizzata con metodiche istopatologiche tradizionali, che richiedono tempi di realizzazione lunghi, appaiono laboriose e spesso economicamente svantaggiose. Il micro-array tissutale (TMA) è una nuova tecnica istopatologica, che consente una rapida e meno costosa valutazione di nuovi marcatori su numerosi campioni di tessuto patologico. L’uso dei TMAs appare molto promettente anche nell’applicazione di tecniche di ibridazione in situ, come la FISH. Scopo del nostro studio è quello di indagare lo stato del gene 3p in 122 CRCC usando i TMA con metodica di FISH e correlare i dati con il follow-up dei pazienti. Materiali e metodi. Per questo studio abbiamo selezionato 122 campioni di CRCC da nefrectomie radicali e parziali, provenienti dagli archivi del Dipartimento di Patologia dell’Università di Verona. Nel corso della revisione critica é stato definito il grado di Fuhrman e lo stadio TMN al momento della diagnosi. Dai 122 campioni tissutali inclusi in paraffina sono stati allestiti 13 nuovi TMA-blocchetti di paraffina, da ciascuno dei quali sono state ottenute sezioni di 4 micron per le colorazioni di riferimento in ematossilina-eosina, per le indagini di (AE1/AE3, CD10, CAM5.2, CK7 e Vimentina) e di FISH. La FISH è stata realizzata applicando una miscela di due sonde DNA: una centromerica per il cromosoma 3 e una subtelomerica locus-specifica per 3p25. Per valutare la presenza della delezione 3p, abbiamo contato il numero di segnali nucleari sia per la sonda subtelomerica che per la sonda centromerica e calcolato la ratio tra 3p/CEP3; abbiamo considerato delete per 3p tutte le neoplasie con ratio 3p/CEP3 inferiore a 0,7, in accordo con precedenti esperienze. Risultati: L’età dei pazienti variava da 30 a 86 anni (media 60 aa), 31 pazienti erano femmine, 91 maschi. Il grado di Furhman nei 122 casi ha mostrato la seguente distribuzione: grado 1 in 6 casi, grado 2 in 52 casi, grado 3 in 52 casi e grado 4 in 12 casi. Le dimensioni del tumore variavano da 2 cm a 19 cm. La stadiazione TNM al momento della diagnosi ha evidenziato una distribuzione non uniforme dei casi (57 casi con stadio pT1, 25 con pT2, 10 con pT3a, 25 con pT3b, e 5 con pT4); interessamento linfonodale è stato osservato in 5 casi (1 caso con stadio pT3a, 3 con stadio pT3b, 1 con pT4), mentre 17 dei 122 casi esaminati hanno evidenziato diffusione metastatica (2 casi con stadio pT1, 2 con pT2, 3con pT3a, 8 con pT3b, e 2 con pT4). I dati di follow-up sono stati raccolti per tutti i 122 pazienti selezionati: 36 pazienti sono morti di malattia, 8 pazienti sono morti per cause non correlate alla malattia, 77 pazienti erano vivi senza evidenza di malattia, ed 1 paziente era vivo, in progressione di malattia. I tempi di follow-up andavano da un minimo di 2 mesi ad un massimo di 168 mesi. Secondo i criteri esposti nella sezione Materiali e Metodi, in relazione al numero di nuclei ottenuto per ciascun tumore, i casi informativi sono stati limitati a 110, sui quali abbiamo contato dai 60 agli 85 nuclei per ciascuno. Per i restanti 12 casi, non abbiamo potuto raggiungere il numero sufficiente di nuclei per la valutazione dei segnali centromerici e locus-specifici, per la presenza di focali aree emorragiche o necrotiche della neoplasia. Al contrario, tutti i campioni non neoplastici sono stati valutati correttamente, grazie all' integrità della componente tubulare del parenchima renale. Tra i 110 casi valutabili abbiamo osservato delezione del 3p in 78 casi (71%), con un rapporto 3p/CEP3 di 0,46-0,68 (media: 0,55), mentre I restanti 32 casi (29%) hanno mostrato un rapporto da 0,72 a 1,1 (media: 0,92), e pertanto sono stati considerati negativi. L’analisi dei campioni di rene non neoplastico ha mostrato un rapporto 3p/CEP3 costantemente al di sopra del valore soglia di 0,7, (0,95-1,2). Correlando i risultati delle analisi FISH per lo stato del gene 3p25 abbiamo evidenziato nei casi deleti una prevalenza (78%) di basso stadio (pT1-pT2), contro solo un 22 % di casi con stadio elevato (pT3-pT4). Per quanto riguarda invece I casi non deleti, abbiamo osservato una prevalenza di stadi elevati (66%) contro un 34 % di casi a basso stadio. Correlando I dati di FISH con il grado di Fuhrman per i casi deleti non abbiamo evidenziato significative variazioni nella distribuzione tra bassi ed alti gradi, mentre abbiamo potuto mettere in evidenza una tendenza all'alto grado nei casi non deleti (G3:47%,G4:25%). Infine per ciò che riguarda le correlazioni con la sopravvivenza dei pazienti, tra coloro che mostravano una delezione del 3p il 62% é vivo senza evidenza di malattia, rispetto a solo il 14% che è morto di malattia. Per i 32 casi con 3p non deleto, il 71% dei pazienti è morto di cancro, mentre il 21% é vivo senza evidenza di malattia. Su un totale di 110 casi valutati, il 56% dei pazienti vivi, senza evidenza di malattia, mostrano delezione di 3p, mentre il 20% dei pazienti morti di malattia non presenta tale alterazione genica. Infine, dei 16 casi con malattia metastatica, di cui 5 con coinvolgimento linfonodale, 6 casi hanno mostrato delezione del 3p, mentre 10 casi erano non deleti. Discussione Le analisi citogenetiche hanno assunto un ruolo sempre più importante come strumento per la diagnosi e la categorizzazione dei CRCC. Analisi genetiche condotte con metodica FISH potrebbero beneficiare dell’utilizzo dei TMA. L’uso dei TMA è ideale per gli studi genetici volti alla caratterizzazione di eventuali bersagli molecolari per nuove strategie terapeutiche. Infatti grazie alla possibilità di valutare su migliaia di campioni l’espressione di differenti markers molecolari, si ottiene una considerevole diminuzione dei tempi di lavoro e una riduzione di più del 90% delle sonde utilizzate con notevole abbattimento dei costi. Numerosi studi genetico-molecolari hanno stabilito che la perdita del braccio corto del cromosoma 3 rappresenta uno degli eventi iniziali ed un “marker” genetico per i CRCC, ma ci sono solo pochi lavori nei quali la delezione del 3p viene presa in considerazione come marker prognostico di tale variante neoplastica. Recentemente, Klatte e isuoi collaboratori hanno evidenziato una associazione tra perdita del 3p/VHL e miglioramento della sopravvivenza con diminuzione del rischio di morte in 282 pazienti affetti da CRCC. In conclusione, Il nostro studio : 1. Conferma l’uso dei TMA come tecnica affidabile per le analisi genetiche di FISH su tessuto neoplastico fissato in formalina e incluso in paraffina. 2. Conferma i dati della letteratura riguardo lo stato di 3p nei CRCC, con un 71% di casi che hanno mostrato delezione del 3p, che inquadrano questa alterazione genetica come un marker specifico per tali neoplasie. 3. E’ in accordo con le recenti osservazioni circa un potenziale ruolo prognostico della perdita del 3p nel CRCC.

Background Renal cell carcinoma (RCC) accounts for approximately 3% of all adult malignancies. More than 40% of RCC patients die of the disease, and the vast majority of them are represented by clear-cell renal cell carcinoma (ccRCC). Initiation and progression of ccRCC is due to genetic alterations. Genes potentially involved in kidney cancer include the von Hippel-Lindau gene on chromosome 3p; specifically, loss of the short arm of chromosome 3 represents the main genetic aberration in ccRCC and has to be considered as one of the primary events in the development of this neoplasia. Conversely there are only few studies in which 3p deletions are considered as a potential prognostic marker in ccRCC. Validation of prognostic markers in multiple clinical specimens has been usually performed by traditional histopathological techniques, which are time consuming, labour intensive and economically costly. The tissue microarray (TMA) is a new histopathologic technique which allows the rapid and cost effective validation of novel markers in multiple pathological tissue specimens. TMAs seem to be very promising for the application of in situ hybridization techniques, including FISH analyses. Aim of our study is to investigate the gene status of 3p in 122 ccRCC using tissue microarrays with FISH and correlate this data with follow up of the patients. Material and methods For this study we have selected 122 ccRCC tumor specimens, obtained from radical or partial nephrectomies by the Department of Pathology of the University of Verona. In the critical review, we defined Fuhrman nuclear grade and TNM staging at diagnosis. Tissues from 122 histology paraffin blocks have been accurately arrayed into newly created 13 TMA paraffin blocks. Consecutive, 4 µm thick sections were obtained by each TMA paraffin block, for hematoxylin and eosin staining and for immunohistochemistry (AE1/AE3, CD10, CAM5.2, CK7 and vimentin) and FISH analyses. FISH was performed with a mixture of centromeric-satellite DNA probes for chromosome 3 and subtelomeric probes for 3p25. To evaluate the presence of 3p deletion, we scored the number of nuclear signals for both subtelomeric and centromeric probes, and calculated the ratio between 3p/CEP3; we considered as 3p deleted all the neoplasms with ratios 3p/CEP3 below 0.7, according to previous experiences. Results: The age of patients ranged from 30 to 86 years with an average age of about 60 years, 31 patients were female, 91 male; Fuhrman grade was distributed among grade 1 (6 cases), grade 2 (52 cases), grade 3 (52 cases) and grade 4 (12 cases). The tumor size ranged from 2 cm to 19 cm. The TNM staging at diagnosis showed an uneven distribution of cases (57 cases with pT1 stage, 25 with pT2,10 with pT3a, 25 with pT3b, and 5 with pT4). Lymph node involvement at diagnosis was observed in 5 cases (1 case with pT3a stage, 3 with pT3b, 1 with pT4). Metastatic spread at diagnosis was found in 17 of the 122 examined cases ( 2 cases with pT1 stage, 2 with pT2, 3 with pT3a, 8 with pT3b, and 2 with pT4). Follow-up data were available for all 122 selected patients: 36 patients died of disease, 8 patients died for unrelated causes, 77 patients were alive with no evidence of disease, and 1 patient was alive with disease progression. The follow-up data were based on a time-lapse ranging from a minimum of 2 months to a maximum of 168 months. According to the criteria exposed in the Methods section, related to the number of nuclei to be scored for each tumor sample, informative cases were limited to 110. For the remaining 12 cases, we could not reach the adequate number of nuclei to evaluate for centromeric and locus-specific signals, due to the presence of focal hemorrhagic or necrotic areas; nevertheless, the number of nuclei which could be evaluated in these cases ranged from 60 to 85. Conversely, all the non neoplastic renal samples could be scored, due to the integrity and the well represented tubular component of kidney parenchyma. Among the 110 evaluable cases, we could be able to identify 3p losses in 78 tumor cases (71%), with ratios 3p/CEP3 ranging from 0.46 to 0.68 (mean: 0.55); the remaining 32 cases (29%) showed ratios ranging from 0.72 to 1.1 (mean: 0.92), and were considered to be not deleted. The analysis of non neoplastic renal parenchyma showed ratios 3p/CEP3 consistently above the cut-off value of 0.7, ranging from 0.95 to 1.2. Correlating the results of the FISH analysis for 3p25 gene status with stage, cases showing 3p deletion were predominantly low stage, with 78% included in pT1-T2 categories, whereas 22% were high stage, included in pT3-T4 categories; conversely, non deleted cases were mostly high stage (66%) with only one third at low stage (34%). With regard to the correlation between Fuhrman grade and 3p deletion, we could not find significant variations in the distribution of grade; in contrast, non deleted cases showed a prevalence of high grade (g3: 47%, g4: 25%). About patients’ follow-up, from among the 78 cases with 3p deletion, 62% were alive with no evidence of disease, compared with only 14% who died of disease. For the 32 cases without 3p deletion, 71% died of cancer, and 21% are alive with no evidence of disease. Out of a total of 110 cases, 56% of patients who were alive with no evidence of disease, showed deletion of 3p, whereas 20% of patients who died of disease had no evidence of 3p deletion. Finally, the 16 cases with metastatic disease, 5 of which with lymph node involvement, 6 cases showed 3p deletion, while 10 cases had no deletion. Discussion: Cytogenetic analyses have emerged as a powerful tool for diagnosis and classification of ccRCC. FISH genetic studies could greatly benefit from TMA procedures. TMA- technology are ideally suitable for genomic based diagnostic and drug target discovery because allows rapid visualization of molecular markers in thousands of tissue specimens, with considerable diminution in time consuming activities and reduction of more than 90% the amount of probes to be utilized. Several reports have established that loss of the short arm of chromosome 3 has to be considered as one of the primary events in the development of ccRCC, and a specific “hallmark” for this histotype; nevertheless, there are only few studies in which 3p deletions are considered as a potential prognostic marker in ccRCC. Recently, Klatte et al. showed that 3p/VHL loss was associated with improved survival and decreased risk of death in 282 patients affected by ccRCC. In conclusion, our study: 1. Confirms that TMA is a reliable technique for genetic investigations on formalin fixed, paraffin embedded neoplastic specimens by FISH. 2. Is in keeping with previous experiences, to confirm that loss of 3p is a specific, genetic marker for ccRCC. 3. Is in agreement with previous observations of a potential prognostic role of 3p deletion in ccRCC.