Approcci diagnostici alla sindrome adreno-genitale: dallo screening neonatale al follow-up

Background: La sindrome adreno-genitale è una patologia ereditata con modalità autosomica recessiva, causata dal deficit di uno degli enzimi necessari per la biosintesi del cortisolo a partenza dal colesterolo, a livello del surrene. Nel 90-95% dei casi l’enzima deficitario è la 21-idrossilasi. Mutazioni del gene CYP21A2, che codifica per la 21-idrossilasi, possono causare un difetto enzimatico di variabile gravità, che si estrinseca clinicamente con caratteristiche eterogenee: da una forma classica, a insorgenza precoce, a una forma non classica, a insorgenza tardiva. L’analisi molecolare del gene CYP21A2 si è rivelata utile per confermare la diagnosi nei bambini affetti, per stabilire la diagnosi nei casi dubbi e infine riveste un ruolo fondamentale nella diagnosi prenatale dei soggetti a rischio. È stata, inoltre, riscontrata una buona correlazione genotipo-fenotipo e questo rafforza l’importanza e l’utilità dell’indagine genetica come conferma diagnostica di secondo livello. Scopo: Gli scopi di questa tesi sono: confermare la diagnosi di deficit di 21-idrossilasi mediante analisi molecolare del gene CYP21A2 in bambini con quadro clinico suggestivo di sindrome adreno-genitale; analizzare la correlazione genotipo-fenotipo nei soggetti con deficit di 21-idrossilasi; valutare l’utilità della diagnostica molecolare nella gestione clinica di tali pazienti. Soggetti e Metodi: Sono stati studiati 21 bambini con sospetto clinico di sindrome adreno-genitale da deficit di 21-idrossilasi. Tutti i bambini, i loro genitori e, quando possibile, anche i fratelli, sono stati sottoposti ad analisi genetica per il riscontro di mutazioni di CYP21A2, tra il 2008 e il 2010, dopo aver ottenuto il consenso informato dei genitori. Sulla base dell’attività enzimatica residua specifica per le mutazioni riscontrate, determinata in vitro, i bambini sono stati, poi, suddivisi in 3 gruppi: pazienti con mutazioni che inibiscono completamente l’attività enzimatica (gruppo A); pazienti con mutazioni responsabili della produzione di enzimi con attività pari all’1-2% di quella normale (gruppo B); soggetti con mutazioni che originano enzimi la cui attività corrisponde al 20-60% del normale (gruppo C). L’analisi genetica del gene CYP21A2, è stata attuata usando DNA isolato da campioni di sangue periferico, successivamente si è provveduto all’amplificazione in vitro del gene tramite PCR e al sequenziamento degli esoni presenti nel gene stesso. Infine, l’uso della nuova metodica MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), ha permesso di identificare delezioni e/o duplicazioni eventualmente presenti nel gene in esame. Risultati: Due bambini (10%) appartengono al gruppo A, 2 (10%) al gruppo B e 8 (40%) al gruppo C. Quattro pazienti (20%) presentavano mutazioni allo stato eterozigote e altri 4 (20%) pazienti non mostravano alcuna mutazione causativa di sindrome adreno-genitale. Una paziente aveva un genotipo particolarmente complicato costituito da 4 geni e presentante anche una nuova mutazione (R25W) di cui non si conosce l’attività enzimatica residua; pertanto non è stato possibile inserirla nella classificazione sopra menzionata. Tutti i pazienti dei gruppi A e B si presentavano con una forma classica con perdita di sali. Tra i bambini del gruppo C vi sono omozigoti o eterozigoti composti per mutazioni con attività enzimatica residua compresa tra il 20 e il 50%, la maggior parte di questi pazienti (87.5%) presenta la mutazione Val281Leu. Tutti questi pazienti presentavano forma non classica di malattia. Un’ottima correlazione (pari al 100%) tra i livelli di 17-OHP (17-idrossiprogesterone) post stimolazione con ACTH e il genotipo è emersa per i soggetti dei gruppi A, B, C; buona la correlazione per i soggetti eterozigoti (75%). I soggetti non affetti hanno, invece, presentato livelli di 17-OHP oscillanti tra quelli dei soggetti con forma non classica e quelli dei soggetti eterozigoti. Infine, non sono emerse differenze tra i livelli degli androgeni in soggetti dello stesso gruppo, ma presentanti mutazioni differenti o la stessa mutazione ma allo stato omozigote, eterozigote composto o emizigote. Conclusioni: La diagnostica molecolare del gene CYP21A2 ha permesso di confermare la diagnosi di sindrome adreno-genitale nel 69% dei bambini con clinica suggestiva per deficit di 21-idrossilasi. La correlazione fenotipo-genotipo nei soggetti affetti è risultata ottimale. Non si sono invece delineati quadri clinici di gravità differenti, almeno all’esordio, nell’ambito dei pazienti dello stesso gruppo ma con mutazioni differenti. Si può, quindi, concludere che l’analisi genetica nel deficit di 21-idrossilasi è di ausilio nella diagnostica, e potrebbe essere utile per migliorare la gestione clinica e il follow-up dei pazienti affetti.

Background: Mutations of CYP21A2 gene are responsible of 21-hydroxylase deficiency (21-OHD), the most common enzymatic defect causing congenital adrenal hyperplasia (CAH). Objective: Aims of our study were: to confirm the diagnosis of 21-OHD by the analysis of CYP21A2 in infants with clinical features of 21-OHD; to analyze the genotype-phenotype relationship in these infants. Population and methods: We studied 21 children with clinical features of 21-OHD: 4 babies presented a salt-wasting form of CAH, 12 a premature pubarche and 5 an elevated 17-OHP level at newborn screening. All of them and their parents were submitted to genetic analysis of CYP21A2, performed by PCR, MLPA and exons and promoter sequencing. Patients were classified in 3 groups according to predict mutations’ severity: severe (group A), moderate (group B) or mild (group C). Results: The most frequent mutation in our population was V281L. All children in group A (2) and B (2) presented a salt-wasting form of CAH. Eight children were in group C and had a non classical form of CAH. Four infants were heterozygotes for 21-OHD and other 4 children did not present mutations in CYP21A2. A girl clinically presenting a non classical form of CAH was a compound heterozygote for Q318X and R25S, a new mutation whose residual enzymatic activity is not known, moreover she shown 4 genes at MLPA analysis. Analyzing the correlation between the 17-OHP levels after ACTH stimulation test and the genotype, we found an optimal relationship in patients of all three groups. All affected children presented a 17-OHP level after ACTH stimulation greater than 100 nmol/L. Conclusion: CYP21A2 analysis permitted to confirm the diagnosis of 21-OHD in 61.9% of our children. To improve this percentage we suggest to perform the analysis of CYP21A2 only when 17-OHP after ACTH stimulation is greater than 100 nmol/L. We confirm an optimal genotype-phenotype relationship in the 21-OHD patients.