A novel approach to the analysis of Carbohydrate-Deficient Transferrin (CDT) based on capillary electrophoresis with in-line immunosubtraction.

La diagnosi oggettiva di abuso di alcol ha una grande rilevanza in diversi settori della medicina clinica e forense, tra cui gastroenterologia, cardiologia, neurologia e psichiatria, medicina del lavoro e del traffico, ecc patologia forense.Dai dati della Società Italiana di Alcologia emerge che in Italia sono circa 32 milioni le persone che bevono regolarmente, mentre sono 3.5 milioni coloro che bevono in maniera inadeguata,cioè che arrivano a manifestare sintomi da intossicazione acuta. Gli alcolisti, ovvero i soggetti alcool dipendenti con patologie correlate, sono circa un milione, mentre i decessi per cause alcol-correlate sono circa 30.000 all’anno, dato significativo se paragonato ai 1000 decessi/anno per tossicodipendenza. L’uso di alcol in Italia rappresenta la quarta causa di morte. Negli ultimi anni, in aggiunta al tradizionale approccio diagnostico basato su enzimi epatici, MCV e gamma-GT, è stato introdotto nella pratica di laboratorio un biomarker più specifici, come la transferrina carboidrato carente (CDT). La transferrina sierica è una molecola con peso molecolare di 79,5 KDa contenente due catene di polisaccaridi, tali catene hanno strutture ad antenna con due, tre o quattro ramificazioni e ogni antenna termina con una molecola di acido sialico. Nel siero si trovano molecole di transferrina prive di acido sialico dette asialo-Tf e altre forme con più o meno acido sialico fino ad un massimo di otto. La CDT è un gruppo di glicoforme minori della transferrina, che comprende asialo-Tf, monosialo-Tf, diasialo-tf, la cui concentrazione sierica, come ampiamente riportato in letteratura, è strettamente correlata con l'assunzione cronica di alcol. A causa delle importanti conseguenze personali e legali della diagnosi di abuso di alcol, è importante avere metodo specifico e selettivo per la determinazione di questo marcatore. L’obiettivo analitico consiste nell’effettuare misure quantitative delle isoforme CDT rispetto alle isoforme non-CDT. Ma la somiglianza strutturale tra isoforme CDT e non-CDT, la bassa concentrazione delle isoforme CDT rispetto alla transferrina totale, nonché la microeterogeneità della transferrina rendono indispensabile l’uso di tecniche con elevato livello di specificità e sensibilità. L'analisi strumentale della transferrina carboidrato carente, è più comunemente svolta in cromatografia liquida ad elevate prestazioni (HPLC) o elettroforesi capillare (CZE). Tra queste due tecniche, l’elettroforesi capillare mostra una maggiore efficienza e produttività, ma presenta una selettività minore rispetto all’HPLC, a causa di una lunghezza d'onda UV meno specifica. Per questo motivo, il presente lavoro è stato finalizzato allo sviluppo di un metodo in elettroforesi capillare per la determinazione della CDT nel siero, al fine di ottenere un’identificazione inequivocabile delle isoforme della CDT. Le condizioni analitiche sono le seguenti: capillare uncoated , 30 m X 60 cm (L= 50 cm effettivi al detector); buffer di corsa composto da 100 mM acido borico e 6 mM DAB (1,4-Diamminobutano), pH a 8.3 con NaOH; potenziale 30 kV; temperatura 25°C; lunghezza d'onda 200 nm; secondo queste condizioni elettroforetiche, si è ottenuta una buona separazione delle isoforme della transferrina, permettendo una identificazione univoca dei picchi della CDT. Al fine di eliminare possibili interferenti e per ottenere una più specifica e chiara identificazione delle isoforme, è stata effettuata una immunosottrazione in-line, iniettando direttamente una plug di anticorpo specifico per la transferrina subito dopo il campione. Questo approccio analitico è stato quindi applicato con successo in campioni dubbi o che presentavano picchi interferenti.

The objective diagnosis of alcohol abuse has a high relevance in different areas of clinical and forensic medicine, including gastroenterology, cardiology, neurology and psychiatry, occupational and traffic medicine, forensic pathology etc. In the recent years, in addition to the traditional diagnostic approach based on liver enzymes, MCV and gamma-GT, a more specific biomarker, such as Carbohydrate Deficient Transferrin (CDT), has been introduced in the laboratory practice and is now widely used worldwide. Transferrin glycoforms, collectively referred as CDT, include the asialo-Tf, monosialo-Tf and disialo-Tf isoforms. Moreover, CDT serum concentration is lower than 1,5% of total transferrin amount. That an increase of the “total CDT” (asialo-Tf + monosialo-Tf + disialo-Tf) occurs after a persistent alcohol intake was confirmed in the literature. The instrumental analysis of Carbohydrate Deficient Transferrin (CDT), is most commonly carried out by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) or Capillary Zone Electrophoresis (CZE). Between these two techniques, CZE shows higher efficiency and productivity, but is often reported to be inferior to HPLC in terms of selectivity, because of a less specific UV detection wavelength than HPLC. On these grounds, the present work was aimed at the development of an improved CZE method for CDT determination including an on-line immunosubtraction step specifically aimed at enhancing the analytical specificity of CZE determination. The analytical conditions were as follows: uncoated fused silica capillary, 30 m X 60 cm (L= 50 cm to detector); running buffer, 100 mM borate and 6 mM DAB (1,4-Diaminobutane), pH 8.3; voltage, 30 kV; temperature, 25°C; detection, 200 nm. Under the described CZE conditions, a baseline separation between all the CDT related peaks was achieved with good analytical performances in terms of both precision and accuracy. In order to achieve unequivocal recognition of the CDT peaks, an in-capillary immunosubtraction step was included by loading a plug of anti-human transferrin antibody solution after the sample plug. This analytical approach was applied successfully to recognize CDT peaks in the presence of potential interferences.