Human mesenchymal stem cells as a source for lung epithelial regeneration

Le malattie polmonari sono una delle principali cause di morte a livello mondiale e per molte di queste, il danno epiteliale costituisce uno step patogenetico cruciale. Per alcune di queste patologie che richiedono il trapianto polmonare, quale ad es. la fibrosi cistica, è stato recentemente suggerito un approccio alternativo basato sull' utilizzo di cellule staminali per la rigenerazione epiteliale. Tuttavia, il successo di questa strategia risulta al momento difficilmente raggiungibile a causa delle scarse informazioni disponibili circa le popolazioni staminali residenti nel polmone coinvolte in questo processo. In aggiunta a questo, sono stati effettuati dei test per verificare la possibilità di utilizzo di popolazioni di staminali esogene, quali ad esempio le cellule staminali mesenchimali (MSC), ma anche in questo caso i risultati, in termini di differenziamento epiteliale, sono stati contradditori ed insoddisfacenti. Il nostro lavoro si basa sull' evidenza che MSC umane (hMSC) sono state isolate non solo nel midollo osseo (BM-hMSC) ma anche in altri organi incluso il polmone; inoltre, differenti lavori suggeriscono che il tessuto di origine possa essere responsabile di specifiche proprietà differenziative delle MSC. Pertanto, nel nostro lavoro abbiamo voluto verificare se hMSC residenti, caratterizzate in confronto con le BM-hMSC, potessero essere isolate dal tessuto polmonare ed indotte a differenziare in vitro in cellule epiteliali respiratorie. I nostri risultati hanno dimostrato che dal polmone può essere isolata ed espansa una popolazione di cellule umane simil mesenchimale (Lung-hMSC) che presenta le tipiche proprietà biologice di tutte le hMSC quali immunofenotipo, potenziale diferenziativo multilineare, capacità di auto-mantenimento, clonogenicità e meccanismi immunoregolatori. Inoltre, le Lung-hMSC hanno un profilo genico di staminalità simile alle BM-hMSC, ma risultano caratterizzate da una significativa aumentata espressione del marker di staminalità Nestina, sia a livello di trascritto che di proteina. In aggiunta, abbiamo dimostrato che le Lung-hMSC a seguito di trattamento con acido retinoico (RA) per l'induzione del differenziamento epiteliale, sono risultate più propense ad andare incontro alla transizione mesenchimo-epiteliale (MET). Questa caratteristica è stata evidenziata dal cambio di morfologia (che da allungata è divenuta poligonale) ed anche dalle significative variazioni di espressione genica, rivelate con qRT-PCR, che hanno mostrato una massivo aumento dei messaggeri di specifici geni epiteliali (citocheratina 18, proteina delle tigh-junction ed occludina) e contemporaneamente una diminuzione dei trascritti genici di alcuni geni mesenchimali (vimentina, snai2 e thy1). Il fenomeno della MET in vitro è risultato limitato ad una piccola percentuale di hMSC e la transizione verso un fenotipo epiteliale non è risultata completa, come confermato dalla presenza di cellule coesprimenti proteine sia epiteliali che mesenchimali. Tuttavia il trattamento con RA è risultato capace di indurre una parziale funzionale polarizzazione epiteliale, anche in questo caso più evidente nelle Lung-hMSC che nelle BM-hMSC, come verificato tramite analisi della resistenza elettrica trans-epiteliale (TEER). Tutti questi dati nel loro insieme suggeriscono che le Lung-hMSC possono essere indotte alla transizione epiteliale più semplicemente delle BM-hMSC, e questo potrebbe costituire il primo passo per la pianificazione di strategie rigenerative volte alla rigenerazione di un epitelio polmonare a seguito di danno.

Lung diseases are leading causes of death worldwide and, for many of them, epithelial injury is a crucial pathogenetic step. For those diseases that require lung transplant as ultimate therapy, such as cystic fibrosis, stem cell therapy has been recently suggested as alternative approach for lung epithelial regeneration. Nevertheless, this goal remains far from being realized due to the lack of understanding the identity and the role of resident stem cell populations involved in this process, as well as the finely tuned mechanisms controlling lung tissue regeneration. In addition, the potential usefulness of the administration of exogenous stem cell populations, such as mesenchymal stem cell (MSC), has been tested with contradictory and unsatisfactory results in terms of lung epithelial differentiation. Our work is based on the evidence that human MSC (hMSC) have been found not only in the bone marrow (BM-hMSC), but also in large variety of other organs including the lung; in addition, different reports suggest that the tissue of origin could be responsible of the specific differentiation properties of MSC. Thus, our aim was to verify if resident hMSC, as characterized by comparative analysis with BM-hMSC, can be isolated from the lung and induced to differentiate in vitro into respiratory epithelial cells. Our results show that human lung MSC-like populations (Lung-hMSC ) can be isolated and expanded in vitro and display the typical biological properties of all hMSC, such as immunophenotype, multilineage differentiation potential, self-renewal capacity, clonogenicity and immune regulatory mechanisms. Moreover, Lung-hMSC display similar stemness gene profile as compared to BM-hMSC, but express significative higher levels of the stemness marker Nestin both at mRNA and protein levels. Nevertheless, we found that Lung-hMSC , after retinoic acid (RA) treatment to induce epithelial differentiation, resulted more prone to undergo mesenchymal to epithelial transition (MET) as compared to BM-hMSC. This property was highlighted by the change from spindel shape to cobblestone morphology and by the statistically significant upregulation of specific epithelial genes (cytokeratin 18, tight junction protein and occludin) together with the downregulation of mesenchymal genes (vimentin, snai2 and thy1), as assessed by qRT-PCR. In vitro MET is limited to a small percentage of hMSC and the transition to a fully differentiated epithelial phenotype is not complete, as confirmed by the presence of cells coexpressing both epithelial and mesenchymal proteins. Nevertheless, the treatment with RA is capable of inducing also a partial functional epithelial polarization, more evident in Lung-hMSC than in BM-hMSC, as assessed by trans-epithelial electric resistance (TEER). All these data suggest that Lung-hMSC can be efficiently induced to undergo epithelial differentiation more easily than BM-hMSC, and this may represent the first step to plan regenerative strategies aimed to the regeneration of lung injuries.