Plant Carotenoids: functional genomicof xanthophylls biosynthesis and rolein Arabidopsis thaliana

Il termine “xantofille” definisce un gruppo di molecole presenti in tutti gli organismi autotrofi ossigenici, dalle diatomee fino alle piante superiori. Le xantofille sono anche presenti nei cianobatteri. Nelle piante superiori, emerge una caratteristica peculiare di questa classe di composti: l’elevato grado di conservazione di questi carotenoidi in numerosi taxa vegetali, in termini sia di specie molecolari sintetizzate che di abbondanza relativa delle molecole prodotte. Da un punto di vista biologico, un così elevato grado di conservazione suggerisce una funzione specifica e peculiare per ciascuna delle specie molecolari descritte nelle piante superiori. In questa tesi di dottorato, abbiamo deciso di intraprendere il compito (ambizioso) di attribuire una funzione a ciascuna specie di xantofilla delle piante superiori, al fine di integrare le attuali conoscenze in questo campo. Nella parte seguente, sono riassunti i principali risultati ottenuti. Sezione A. Ciclo delle xantofille e stress fotossidativo: studio delle basi molecolari del meccanismo di fotoprotezione dipendente dalla zeaxantina. In questa sezione, la zeaxantina è analizzata in relazione alla sua capacità di legarsi alle proteine Lhc e di modularne le proprietà spettroscopiche. Anche il ruolo della zeaxantina nella protezione della membrana dei tilacoidi dallo stress fotossidativo è stato studiato. Nella prima parte (A.1), il primo lavoro riassume le conoscenze sulla dinamica della zeaxantina all’inizio della mia tesi di dottorato. Viene presentata una panoramica sugli aspetti meccanicistici nell’ambito della notevole conservazione in composizione delle xantofille che si ritrova nelle piante superiori, e si propone un modello per l’interazione tra ciclo delle xantofille e proteine Lhc. Risultati sperimentali precedenti hanno evidenziato come le xantofille vadano incontro ad un cambiamento dinamico sia in composizione che in distribuzione nelle proteine Lhc. In questo lavoro è stato dimostrato che lo scambio di xantofille nelle proteine Lhc è controllato da determinanti strutturali: la velocità di scambio della violaxantina con la zeaxantina è determinata dalla struttura della singola subunità antenna; l’efficienza dello scambio è dipendente dal pH lumenale, mentre esso non richiede lo stato attivato dell’enzima violaxantina deepossidasi (VDE). Lo scambio delle xantofille modula l’efficienza di raccolta della luce nel PSII e aumenta la protezione nei confronti della perossidazione dei lipidi di membrana: nel complesso, la zeaxantina agisce come un sistema di trasduzione del segnale per A) la regolazione e B) la protezione del macchinario fotosintetico. Nelle parti seguenti, i punti suddetti sono esaminati nel dettaglio. Nella sezione A.2, la caratterizzazione del mutante npq2lut2 di A. thaliana ha permesso di valutare quale effetto abbia in vivo l’accumulo costitutivo di zeaxantina come unica xantofilla. I mutanti mostrano un notevole cambiamento nell’organizzazione sovra-molecolare del PSII: LHCII non forma trimeri, così come i supercomplessi del PSII non sono rivelati; l’abbondanza delle subunità LHCII e CP26 nei tilacoidi è fortemente ridotta. L’accumulo di zeaxantina causa profondi cambiamenti nella funzionalità dell’apparato fotosintetico: le piante mutanti mostrano una totale soppressione delle transizioni stato I-stato II, una riduzione dell’efficienza fotochimica in bassa luce, e raggiungono il punto di saturazione fotosintetico ad intensità luminose maggiori delle piante controllo. Nel complesso, i mutanti mostrano un fenotipo fotosintetico che approssima quello di piante acclimatate ad elevate intensità luminose. Quando esposte a condizioni fortemente fotossidanti, le piante npq2lut2 mostrano un minore livello di fotoinibizione e perossidazione lipidica, evidenze che confermano in vivo il ruolo della zeaxantina come forte antiossidante. Nella sezione A.3, viene analizzato l’effetto del legame della zeaxantina alle subunità Lhc. Il mutante npq2 di A. thaliana accumula costitutivamente zeaxantina; la principale conseguenza sulle proteine Lhc è una minore resa della fluorescenza delle clorofille in vivo rispetto al WT, che deriva da un modificazione nell’interazione pigmento-proteina. La proteina CP26 (antenna minore del PSII) mostra un comportamento peculiare in seguito al legame con la zeaxantina: la subunità CP26, isolata sia da piante npq2 che da piante WT trattate in modo da indurre l’accumulo di zeaxantina, va incontro ad un cambiamento del proprio pI. Questa è la prima evidenza biochimica dell’esistenza di conformazioni multiple nelle proteine Lhc; la transizione da una conformazione all’altra è regolata dal legame della zeaxantina. La velocità del trasferimento energetico tra clorofille e carotenoidi in LHCII isolato è stato misurato attraverso la tecnica di “femtosecond fluorescence upconversion”; i risultati ottenuti sono mostrati nella sezione A.4. Questo nuovo approccio tecnico permette di misurare la frazione di energia trasferita dai carotenoidi alle clorofille attraverso gli stati S1 o S2. LHCII isolato da npq2, che lega zeaxantina, ha una minor quota di energia di eccitazione trasferita alle clorofille attraverso lo stato S2 del carotenoide; al contrario, la quota di energia trasferita attraverso lo stato S1 è meno influenzata dalla composizione in carotenoidi. Sezione B. Le xantofille in fotosintesi: uno studio biochimico e fisiologico per comprendere il significato della loro conservazione filogenetica. Nelle piante vascolari, la composizione in xantofille dei tilacoidi rappresenta una caratteristica altamente conservata e suggerisce un ruolo specifico per ciascuna specie molecolare. L’isopentenil difosfato (IPP) costituisce il punto di inizio della via biosintetica che genera la varietà di xantofille delle piante superiori: diverse reazioni di condensazione e riduzione portano al licopene; esso rappresenta un punto di biforcazione nella via di biosintesi: una ciclizzazione β ed una ε alle estremità della molecola di licopene conduce alla sintesi di luteina, mentre due ciclizzazioni β danno inizio alla via che porta all’accumulo di β-carotene, zeaxantina, violaxantina e neoxantina. In questo lavoro, ho usato un approccio di genomica funzionale in A. thaliana, allo scopo di bloccare specificamente l’accumulo di una o più xantofille e caratterizzarne il fenotipo in vivo. Nella sezione B.1, viene analizzato il mutante lut2, il quale manca di luteina. La mancanza di luteina ha diversi effetti sull’organizzazione e funzione dell’apparato fotosintetico: i livelli di violaxantina sono fortemente incrementati al fine di rimpiazzare l’assenza del pool di luteina; la trimerizzazione di LHCII è impedita; si osserva una diminuzione nella dimensione dell’antenna funzionale; sono ridotte sia la capacità di innescare le transizioni di stato, sia l’attivazione di meccanismi regolatori come l’NPQ. La maggiore sensibilità del mutante lut2 nei confronti dello stress fotossidativo è stata studiata valutando il livello di danneggiamento del tessuto fogliare quando le piante vengono fatte crescere in condizioni fortemente stressanti (elevati irraggiamenti e basse temperature). L’analisi spettroscopica dimostra che questo effetto è conseguenza della minore efficienza della luteina come smorzatore dei tripletti della clorofilla: tali evidenze derivano a) da esperimenti di photobleaching in vitro, e b) da misure di spettroscopia risolta nel tempo, che permettono di seguire la formazione dei tripletti dei carotenoidi in proteine Lhc isolate da piante WT e lut2. Il notevole aumento della sensibilità allo stress fotossidativo che si osserva nel mutante npq1lut2, privo sia di luteina che di zeaxantina, mette in evidenza come le due xantofille abbiano ruoli comuni nella protezione dei tilacoidi. Il ruolo della neoxantina nel processo fotosintetico viene analizzato nella sezione B.2. Il mutante aba4 di A. thaliana accumula meno del 20% dei livelli di neoxantina misurati nel WT, pur mantenendo tutte le altre specie di xantofille. Il ridotto contenuto in neoxantina non influenza la funzionalità del PSII alla luce né la capacità di attivare il meccanismo di dissipazione termica dell’energia di eccitazione in eccesso (NPQ). L’analisi di proteine Lhc isolate da aba4 mostra che la sostituzione compensatoria di neoxantina con violaxantina nelle proteine antenna riduce la capacità di fotoprotezione delle stesse. Sia lo stress fotossidativo in vivo, sia il trattamento dei tilacoidi con agenti sensitivizzanti capaci di produrre specifici ROS, dimostrano che la neoxantina possiede una (inattesa) funzione antiossidante, e suggerisce che questa xantofilla abbia un ruolo nella protezione del macchinario fotosintetico dalle specie reattive dell’ossigeno. La sezione B.3 contiene la descrizione completa delle tappe enzimatiche di idrossilazione del β- carotene in A. thaliana. In aggiunta alle già descritte β-idrossilasi della via di biosintesi dei carotenoidi, chiamate Chy1 e Chy2, viene descritta una terza idrossilasi: si dimostra che Cyp97a3, un paralogo di Lut1, possiede una funzione di idrossilazione dell’anello β. Infatti, il triplo mutante chy1chy2cyp97a3 manca completamente di xantofille β-β (violaxantina, zeaxantina e neoxantina), e mantiene la luteina come unica xantofilla. Il confronto di questo triplo mutante con npq1lut2, privo sia di zeaxantina che di luteina, dimostra che entrambi i genotipi mancano completamente del qE. Tuttavia, un trattamento fotossidativo induce un maggiore livello di fotoinibizione e di perossidazione lipidica in chy1chy2cyp97a3 rispetto a quanto misurato in npq1lut2. Queste evidenze sperimentali suggeriscono un ruolo specifico di neoxantina e/o violaxantina nel preservare i tilacoidi dall’azione dei ROS. Sezione C: La dissipazione termica dell’energia in fotosintesi: studio dei meccanismi di attivazione. Il non-photochemical quenching (NPQ), altrimenti detto quenching (smorzamento) della fluorescenza delle clorofille dipendente dal ΔpH (qE), è un meccanismo rapidamente inducibile che garantisce la dissipazione termica dei fotoni assorbiti in eccesso nel PSII. Esso agisce come un meccanismo di regolazione a feed-back per la raccolta della luce: infatti, è direttamente controllato dal ΔpH nei tilacoidi, a sua volta generato dal trasporto elettronico fotosintetico. In questa sezione, vengono presentati i risultati ottenuti studiando l’induzione di NPQ sia nelle piante superiori (H. vulgare) che nei cianobatteri (C. reinhardtii). Nella sezione C.1, viene descritta la caratterizzazione di un nuovo tipo di non-photochemical quenching indipendente dalla zeaxantina. Nelle piante superiori, un quenching non-photochimico transiente viene indotto e misurato durante la transizione dal buio alla bassa luce. Questo meccanismo è stato ulteriormente analizzato, dimostrando che questo quenching transiente della fluorescenza delle clorofille non è associato alla sintesi di zeaxantina, mentre è accompagnato dalla inattivazione di una frazione dei centri di reazione del PSII. Il fenomeno misurato è compatibile con l’origine di uno stato smorzato entro il PSII, che reverte in seguito all’attivazione del ciclo di Calvin. Il suddetto quenching dei centri di reazione del PSII viene rilevato anche con irraggiamenti saturanti, e continua a mantenere il suo carattere di reversibilità. Con il rilassamento del quenching associato ai centri di reazione, la componente legata all’antenna e dipendente dal ΔpH lo rimpiazza e massimizza la capacità di dissipazione termica dell’energia. Nella sezione C.2, viene valutata la capacità di C. reinhardtii di innescare il meccanismo di NPQ. La modesta ampiezza dell’NPQ normalmente misurata in questo organismo si origina quasi completamente dalle transizioni di stato (qT). Un significativo incremento dell’ampiezza del quenching dipendente da ΔpH (qE) si osserva: a) abbassando la temperatura del mezzo durante le misure di fluorescenza, oppure b) con il blocco dell’utilizzo dell’energia, mutando i geni codificanti per l’enzima Rubisco. In sostanza, il qE viene rilevato in C. reinhardtii in condizioni che riducono pesantemente il trasporto elettronico. In condizioni ottimali di crescita, questa alga sembra produrre un gradiente di pH trans-membrana non sufficiente all’innesco del qE. Di conseguenza, la risposta di quenching dipendente dal ΔpH appare molto meno efficiente di quanto si osserva nelle piante superiori. Sezione D: Caratterizzazione della funzione fisiologica delle ELIPs. Le ELIP sono proteine della famiglia genica Lhc, accumulate nei tilacoidi nelle fasi precoci dell’inverdimento, durante la transizione dallo stato eziolato alla luce. I trascritti delle ELIP e le proteine compaiono durante il processo di de-eziolamento, prima che abbia inizio l’espressione dei geni Lhc, e scompaiono prima che lo sviluppo del cloroplasto sia concluso. Il ruolo fisiologico delle ELIP non è ben conosciuto. L’espressione precoce dei geni elip dopo l’illuminazione di piante eziolate suggerisce che le proteine ELIP abbiano un ruolo nello sviluppo del cloroplasto. In più, poiché tali proteine sono accumulate in condizioni di eccesso di luce, esse potrebbero avere un ruolo nella acclimatazione allo stress fotossidativo, probabilmente attraverso l’interazione con pigmenti fotosintetici: data la similarità strutturale con le proteine LHC, si pensa che le ELIPs leghino pigmenti, clorofille o xantofille. Nella sezione D.1, viene presentato uno studio sul ruolo fisiologico delle proteine ELIP. La produzione e caratterizzazione di linee transgeniche di A. thaliana che sovraesprimono il gene di ELIP2 dimostra che le piante trasformanti hanno una notevole riduzione del contenuto in pigmenti nei cloroplasti. Densità e ultrastruttura dei cloroplasti, così come composizione e funzionalità dei fotosistemi, non sono influenzate dall’accumulo costitutivo di ELIP2; la riduzione del contenuto in pigmenti deriva da un minor numero di fotosistemi assemblati nei tilacoidi. Ulteriori analisi dimostrano che i livelli dei precursori delle clorofille sono fortemente ridotti nelle piante transgeniche per ELIP2, mentre i prodotti di degradazione delle clorofille hanno livelli inalterati rispetto al controllo. Queste evidenze sperimentali suggeriscono un ruolo delle ELIPs nella regolazione dell’accumulo di clorofille nei tilacoidi.

The term “Xanthophylls” defines a group of molecules present in all oxygenic autotrophes, ranging from diatoms to the higher plants. Xanthophylls are also present in cyanobacteria. In higher plants, a peculiar characteristic of this class of compounds emerges: the high level of conservation of these carotenoids among several plant taxa, both in term of molecular species synthesized and of their relative amounts. In a biologist’s view a so high degree of evolutionary conservation strongly suggests a specific and peculiar function for each of the molecular species described in higher plants. Thus, in this phD work, I decided to undertake the (ambitious) task to attribute a function for each xanthophyll species in higher plants, in order to improve existing knowledge in this research field. Here below the major results obtained are summarized. Section A. Xanthophyll cycle and photooxidative stress: insights on the molecular basis of zeaxanthin-dependent photoprotection. In this section, zeaxanthin is analysed in terms of its capacity of binding to Lhc proteins and of modulating their spectroscopic properties. The effects of zeaxanthin in protecting thylakoid membranes from photooxidative stress is also analysed. In the first section (A.1), the first article summarizes the knowledge of the dynamics of zeaxanthin at the beginning of my phD period. We present an overview on the mechanistic aspects in the framework of the highly conserved xanthophylls composition in higher plants, and propose a model for Lhcs-xanthophyll cycle interaction. Experimental results evidence that xanthophylls undergo dynamic changes both in composition and distribution among Lhcs. It is shown that structural determinants control xanthophyll exchange in Lhc proteins: violaxanthin vs. zeaxanthin exchange rate is determined by the structure of individual antenna subunits; the exchange efficiency is dependent on lumenal pH, while it does not require the activated state of violaxanthin de-epoxidase enzyme (VDE). Xanthophyll exchange affects light-harvesting efficiency of PSII and increases protection from lipid peroxidation: zeaxanthin accumulation, thus acts as a signal transduction system, for A) regulation and B) protection of photosynthetic machinery. In the following parts, the above-mentioned points are examined in detail. In section A.2, the characterization of npq2lut2 mutant of A. thaliana, allowed evaluation of the in vivo effect of zeaxanthin as the only xanthophyll. Mutant plants show a strong modifications in the supramolecular organization of PSII: LHCII can not form trimers, as well as PSII supercomplexes are not detectable; abundance of LHCII and CP26 subunits in thylakoid membranes is strongly reduced. Zeaxanthin accumulation causes severe changes in the function of photosynthetic apparatus: plants undergo a suppression of state I-state II transitions, a reduction of photochemical efficiency in low light, moreover, they reach the photosynthetic saturation point at higher light intensity than control plants. On the whole, mutant show a photosynthetic phenotype approaching that of high-light acclimated plants. When exposed to strong photooxidative conditions, npq2lut2 plants show a lower degree of photoinhibition and lipid peroxidation, thus confirming the antioxidant role of zeaxanthin in vivo. In section A.3, the effect of zeaxanthin binding to Lhc subunits is analysed. Mutant npq2 of A. thaliana has a constitutive accumulation of zeaxanthin; main consequence on Lhc subunits is a lower fluorescence yield of chlorophyll in vivo than WT, that comes from a change in pigment-protein interactions. The CP26 subunit (minor antenna of PSII) has a peculiar behaviour upon binding zeaxanthin: CP26, isolated both from npq2 and from WT plants upon a treatment leading to zeaxanthin accumulation, undergoes a change in its pI. This is the first biochemical evidence for the existence of multiple conformations into Lhc proteins; switch from one conformation to the other is regulated by zeaxanthin binding. The rate of carotenoid to chlorophyll energy transfer in isolated LHCII has been measured by femtosecond fluorescence upconversion; results obtained are examined in section A.4. This new technical approach allows to estimate fraction of energy transferred from Cars to Chls either via carotenoid S1 or S2 state. LHCII isolated from npq2 mutant, binding zeaxanthin, has a lower amount of excitation energy transferred to Chls through the carotenoid S2 state; instead, the energy transferred through S1 state is less affected by xanthophyll composition. Section B: Xanthophylls in photosynthesis: biochemical and physiological analysis towards understanding the significance of their phylogenetic conservation. In vascular plants, carotenoid composition of thylakoid membranes represents a conserved feature and suggests a specific role for each molecular species. Isopentenyl diphosphate (IPP) is the starting point for all reactions leading to the variety of xanthophylls that we find in higher plants: several condensation and reduction steps generate lycopene; it represents a bifurcation point in the pathway: one β- and one ε-cyclization of lycopene ends leads to biosynthesis of lutein, while two β-cyclization originate the branch of β-carotene: zeaxanthin, violaxanthin and neoxanthin. In this work, I have used a functional genomic approach on A. thaliana in order to specifically block accumulation of one or more xanthophylls,and characterize the phenotypes in vivo. In section B.1, mutant lut2, specifically depleted of lutein, is analyzed. Lack of lutein has several effect on the organization and function of the photosynthetic machinery: violaxanthin level strongly increases to replace the missing lutein pool; LHCII trimerization is prevented; functional antenna size is decreased; the ability to perform state transition is reduced, as well as regulatory mechanism such as NPQ. The higher sensitivity of the lut2 mutant to photooxidative stress was evaluated through the level of photodamage when plants grow in stressing conditions (i.e. high light and low temperature). Spectroscopic analysis shows that this effect, can be ascribed to the lower efficiency of violaxanthin as chlorophyll triplet quencher: this is confirmed by results of photobleaching in vitro and time-resolved spectroscopy of carotenoid triplet formation, both measured on Lhcs isolated from lut2. The strongly increased photosensitivity of the npq1lut2 double mutant, lacking both zeaxanthin and lutein, highlights the overlapping function of these xanthophylls in photoprotection of thylakoid membranes. The role of neoxanthin in photosynthesis was analysed in section B.2. Aba4 mutant of A. thaliana accumulates less than 20% of WT levels of neoxanthin, retaining all other xanthophyll species. Neoxanthin deficiency does not affect PSII performance in light nor the activation of the thermal energy dissipation mechanisms. In isolated Lhcb proteins, the compensatory substitution of neoxanthin with violaxanthin within antenna proteins yields a lower photoprotection ability than WT lightharvesting proteins. Photooxidative stress in vivo, as well as thylakoid treatments with photosensitizers agents producing specific ROS molecules, shows an (unexpected) antioxidant role of neoxanthin and suggests a fundamental role of this xanthophyll in preserving photosynthetic machinery by reactive oxygen species produced from structures outside PSII. Section B.3 describes the complete elucidation of β-carotene hydroxylation pathway in A. thaliana. In addition to the previously described β-hydroxylases of the biosynthetic pathway of carotenoids, named Chy1 and Chy2, a third β-hydroxylase is described: Cyp97a3, a close paralog of Lut1, and has a function in β-ring hydroxylation. Indeed, triple mutant chy1chy2cyp97a3 completely lacks β-β- xanthophylls (violaxanthin, zeaxanthin and neoxanthin), while it retains lutein as the only xanthophyll. Comparison of this triple mutant with npq1lut2, a mutant lacking zeaxanthin and lutein, shows that both genotypes are completely depleted of qE. Nevertheless, photooxidative treatment induces a higher extent of both lipid peroxidation and photoinhibition in chy1chy2cyp97a3 with respect to npq1lut2. These evidences suggest a specific role of neoxanthin and/or violaxanthin in preserving thylakoid system from ROS. Section C: Thermal energy dissipation in photosynthesis: investigation on activation mechanisms. Non-photochemical quenching (NPQ), also termed ΔpH-dependent quenching (qE), is a rapidly inducible mechanism for the harmless thermal dissipation of excess absorbed photons in PSII. It works as a feed-back regulation mechanism for light harvesting: in fact, it is directly controlled by thylakoid ΔpH, that is formed by photosynthetic electron transport. In this section, results obtained studying the induction of NPQ both in higher plants (H. vulgare) and cyanobacteria (C. reinhardtii) are presented. In part C.1, a characterization of a novel kind of zeaxanthin-independent, non-photochemical quenching is described. In higher plants, a transiently induced non-photochemical quenching measured during transition from dark to low light, is well known and previously described. This mechanism is further analysed, showing that the transient chlorophyll quenching is not associated with zeaxanthin synthesis, while it proceeds through inactivation of a fraction of PSII reaction centers. The phenomenon measured is compatible with the origin of a quenched state inside the PSII, that relaxes upon activation of the Calvin cycle. The above-mentioned PSII reaction centers quenching is also detected at saturating light intensities, and maintains its reversibility character. Following relaxation of this RC associated quenching, the ΔpH-dependent, antenna-associated quenching fully replaces reaction center contribution and leads to full amplitude of energy dissipation. In section C.2, capacity of C. reinhardtii for triggering thermal energy dissipation (NPQ) is analyzed. The moderate amplitude of non-photochemical quenching measured in this alga comes mostly from state transitions (qT). A significant increase in ΔpH-dependent quenching (qE) is observed by: a) lowering temperature of the medium during fluorescence measurements, or b) blocking energy utilization by mutating genes encoding Rubisco. Thus, qE of C. reinhardtii is observed in conditions that strongly slow down electron transport. In optimal growth conditions, this alga seems to produce a trans-membrane ΔpH not sufficient for the triggering of qE. Thereforethe ΔpH-dependent quenching response is somehow less efficient than higher plants. Section D: Characterization of ELIPs physiological function. ELIPs are proteins belonging to Lhc-superfamily, accumulated into thylakoids at the early stage of greening after etiolated-to-light transition. ELIP transcripts and proteins appear during de-etiolation, before starting Lhc gene expression, and disappear before chloroplast development is completed. The physiological role of ELIPs is not well understood. The early expression upon illumination of etiolated seedlings suggests that ELIPs have a role in development of chloroplast. Moreover, since ELIPs are accumulated in conditions of excess light, they could also have a role in the acclimation to photoxidative stress, possibly through pigments interaction: because of their structural similarity with the LHCs, ELIPs are assumed to bind pigments, especially chlorophylls and xanthophylls. In section D.1, an investigation on the physiological role of ELIPs is presented. Production of transgenic lines of A. thaliana overexpressing ELIP2 gene resulted in a pale-green phenotype caused by a marked reduction of the pigment content of the chloroplasts. Chloroplast ultrastructure and density, as well as photosystems composition and functioning, were not affected by constitutive ELIP2 accumulation; reduction of pigment content comes from a decreased number of photosystems assembled in thylkoids. Further analysis showed that chlorophyll precursors were strongly reduced in ELIP2 transgenic plants, while levels of chlorophyll degradation products were not affected. These evidences suggests a role of ELIPs for regulation of chlorophyll accumulation in the thylakoids.