Human skeletal remains: development of DNA extraction and typing methods

Nell’ambito delle indagini genetico-forensi i reperti scheletrici sono spesso il solo materiale biologico disponibile per l'identificazione individuale di soggetti scomparsi e rinvenuti in diverse circostanze quali disastri di massa, guerre, eventi socio-politici e accertamenti della paternità biologica effettuati su soggetti deceduti a seguito di esumazione. Il DNA estratto da reperti ossei è normalmente presente in basso numero di copie (Low Copy Number) e altamente degradato a causa di alterazioni chimico-fisiche derivanti sia dalla datazione del reperto biologico stesso sia dalle condizioni ambientali alle quali il campione viene sottoposto talvolta per lunghi periodi di tempo. L’adeguata procedura di estrazione così come l'amplificazione del DNA, rappresentano step fondamentali per l’acquisizione di profili genetici da campioni scheletrici la cui attendibilità è fortemente influenzata dall’integrità del campione. Per quanto riguarda i resti scheletrici, allo stato attuale non esiste un metodo di estrazione del DNA infallibile e standardizzato, idoneo per la successiva determinazione del profilo genetico, come pure l’amplificazione del DNA mediante marcatori genetici tradizionali quali gli Short Tandem Repeats (STRs) risulta essere talvolta inefficace nei casi che vedono coinvolto del DNA altamente degradato. In questo studio sono state analizzate diverse tipologie di resti scheletrici umani la cui datazione variava da pochi mesi a circa 90 anni post mortem, rinvenuti in ambienti differenti e quindi caratterizzati da un variabile stato di conservazione. E’ stato sviluppato un nuovo protocollo di estrazione del DNA, consistente in un primo step di purificazione del campione decalcificato e lisato, con il tradizionale metodo fenolo-cloroformio, atto a separare fisicamente il DNA da proteine e materiale contaminante quale ad esempio terriccio. Successivamente ciascun campione è stato estratto mediante kit di estrazione basati su differenti principi chimico-fisici, per valutare sulla base dei profili genetici ottenuti, quale fosse il più idoneo ed efficace nell’estrazione del DNA e da quale distretto osseo si potesse ottenere un profilo genetico di migliore qualità. L’associazione tra fenolo cloroformio e uno specifico kit basato su estrazione del DNA mediante colonne cromatografiche, si è rivelato essere il metodo più efficace grazie all’utilizzo del fenolo cloroformio che ha permesso di purificare gli estratti impedendo che detriti di varia natura interferissero con le colonne cromatografiche, occludendole e grazie all’elevata capacità estrattiva del kit in esame. Inoltre, poiché è noto che l’utilizzo di polimorfismi di dimensioni ridotte (Mini Short Tandem Repeats- MiniSTRs) rispetto agli STRs convenzionali risulta essere estremamente efficace nella determinazione di un profilo genetico da campioni di DNA altamente degradato, i primers di otto marcatori STR ampiamente validati e inclusi in numerosi kit commerciali, sono stati ridisegnati in prossimità della regione altamente ripetuta del marcatore prescelto. Gli otto nuovi MiniSTRs sono stati quindi assemblati e suddivisi in due quadruplexes ottenendo prodotti di PCR di dimensioni inferiori a 130 paia di basi. Il protocollo di estrazione presentato in questo studio ha fornito risultati positivi nei reperti scheletrici analizzati, con elettivo riferimento ai campioni ossei quali femore, di diversa datazione e stato di conservazione. È inoltre da sottolineare come le condizioni ambientali a cui resti sono stati esposti, hanno avuto una maggiore influenza sulla stato di degradazione del DNA rispetto all'età dei reperti scheletrici stessi. Mediante l’utilizzo di kit commerciali per l’amplificazione del DNA e delle due mini-STR quadruplexes sono stati ottenuti profili genetici costituiti da minimo 12 STR da tutti i campioni di femore analizzati, permettendo il riconoscimento dei soggetto deceduto, mediante la comparazione del profilo genetico ottenuto con quello dei presunti parenti. Il metodo di estrazione del DNA descritto in questo lavoro e l’introduzione di nuovi MiniSTRs in aggiunta ai kit commerciali disponibili, sono risultati essere efficaci per la determinazione di profili genetici da campioni scheletrici caratterizzati da DNA altamente degradato.

In forensic cases human remains are often the only biological material available for identification of missing persons or unknown remains found in different circumstances such as mass disasters, wars or socio-political events and to solve paternity issues. DNA extracted from bones is often present in low copy number (LCN) and in various states of degradation due to chemical and physical damages produced by intrinsic and extrinsic bone characteristics. Efficient DNA extraction procedures, as well as accurate DNA amplification, are critical steps involved in the process of successful DNA analysis of skeletal samples. Unfortunately, at present there is not an infallible method to recover DNA from very degraded samples due to variations in DNA yield from larger bone fragments that may be attributed to heterogeneity within a bones. In this study different types of human bones ranging in age from few months to 90 years post mortem, found in various states of preservation and conserved in different places, were analyzed. We developed a modified silica based spin columns protocol, consisting in an initial separation of DNA from proteins and waste material, by using phenol-chloroform to better purify samples. Moreover, as the recovery of information from these degraded samples is enhanced by the use of smaller PCR products (Mini Short Tandem Repeats) rather than conventional STRs, eight STR markers included in available commercial multiplex PCR kits, were redesigned by moving forward and reverse primers in close proximity to the STR repeat region. Two PCR quadruplexes were assembled to obtain PCR products less than 130 bp in size. Our modified protocol was successfully employed to extract DNA from long bones of different ages and preservation state. Importantly the use of phenol chloroform consistently increased the amount of DNA that could be extracted from long bones, because it allowed to clean samples preventing that waste material interferes with columns or magnetic beads. Environmental conditions under which remains were exposed, had stronger influence on the state of DNA quality than the age of skeletal remains. Moreover the use of miniSTRs has proposed here could be used in addition to commercial kits, to increase as much as possible the number of markers analyzed. Using amplification commercial kits and the two new mini-STR quadruplex systems we always obtained genetic profiles of at least 12 STR from DNA typing of femur samples. The improvement of DNA extraction methods and the inclusion of robust and powerful miniSTR loci in addition to the commercial available kits, are effective solutions for forensic practices of degraded DNA samples because ensure that difficult casework samples with low amounts of degraded DNA can be fully typed.