La fermentazione degli alimenti rappresenta la più antica applicazione biotecnologica e una delle più economiche ed efficienti forme di bioconservazione dei prodotti alimentari; è inoltre responsabile di molte delle proprietà qualitative, organolettiche e nutrizionali dei prodotti fermentati (gusto, aroma, struttura, consistenza, disponibilità di nutrienti). I microrganismi che maggiormente partecipano ai processi fermentativi alimentari sono i batteri lattici (LAB) e lieviti. Nell’ambito delle produzioni lattiero-casearie gli starter sono colture a elevata concentrazione di LAB che vengono aggiunte al latte da trasformare allo scopo di indirizzare i processi di fermentazione. Le colture starter selezionate di maggior impiego in Italia sono costituite in gran parte da LAB termofili, associazioni di differenti biotipi di Streptococcus thermophilus e miscele di S. thermophilus e altre specie batteriche. Nonostante la specie S. thermophilus sia correlata geneticamente alle specie patogene del genere Streptococcus, essa è utilizzata in modo sicuro da molti secoli nell’alimentazione umana. La non patogenicità di S. thermophilus è supportata, oltre che da una lunga storia di utilizzo sicuro nella produzione alimentare (Iyer et al., 2010), anche dal suo riconoscimento come “Generally Recognised As Safe” (GRAS) dalla Food and Drug Administration (FDA) negli Stati Uniti e dall’inclusione nella lista degli organismi facenti parte del sistema “Qualified Presumption of Safety” (QPS) dell’European Food Safety Authority (EFSA). Negli ultimi decenni la Comunità Europea ha sottolineato l’importanza di una corretta identificazione dei microrganismi impiegati nelle trasformazioni alimentari e la necessità di verificare che non rechino tratti pericolosi, come le antibiotico resistenze e la produzione di composti tossici per l’uomo, come le amine biogene. Per questo motivo sono necessari continui approfondimenti che chiariscano ulteriormente le potenzialità positive e negative di S. thermophilus, nonché la sua capacità di adattarsi alle condizioni ambientali e microbiologiche in cui sviluppa. In tale contesto si inserisce questo progetto di dottorato, che si è posto l’obiettivo di valutare la biodiversità, le caratteristiche di antagonismo ed alcuni aspetti di sicurezza legati alla specie S. thermophilus. La prima parte della ricerca ha avuto come oggetto l’identificazione e la tipizzazione genotipica di una collezione di ceppi appartenenti alla specie S. thermophilus, provenienti da collezioni di laboratorio di diversi gruppi di ricerca italiani e isolati da prodotti lattiero-caseari di diversa tipologia e provenienza geografica. Lo studio della variabilità intraspecifica dei ceppi collezionati, tramite l’applicazione combinata di più metodiche di biologia molecolare, quali PCR specie-specifica, RAPD-PCR, RAPD-PCR e restrizione enzimatica e analisi dei profili plasmidici, ha permesso di stabilire la biodiversità tra di essi e di individuare gruppi di similarità tra ceppi. Il lavoro svolto in questa sezione della tesi ha rappresentato il punto di partenza per affrontare uno studio più ampio di questa specie batterica. Nella seconda parte della tesi è stata valutata l’attività antagonistica di ceppi di S. thermophilus nei confronti di altre specie utilizzate come starter e nei confronti di specie patogene e contaminanti. Alcuni ceppi della collezione si sono distinti per un’attività più spiccata rispetto agli altri, in particolare verso altre specie starter come Streptococcus gallolyticus subsp. macedonicus, Lactobacillus delbruekii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus e altri ceppi di S. thermophilus. Alcuni ceppi hanno mostrato attività antagonistica anche verso Staphylococcus aureus, Escherichia coli ed Enterococcus faecium, anche se in misura minore rispetto all’attività riscontrata verso altri starter. Sono state inoltre studiate alcune caratteristiche chimico-fisiche dei composti con attività inibitoria, nonché la loro cinetica di produzione. La caratterizzazione chimico-fisica delle sostanze con attività inibitoria dei ceppi più performanti è risultata imputabile a composti proteici di dimensioni superiori a 3 Kda, probabilmente termofiline. Le termofiline prodotte sono tutte termoresistenti, stabili in un range di pH compreso tra 2 e 7 e prodotte già all’inizio della fase di crescita dei ceppi. È stata infine valutata la presenza e diffusione dei geni codificanti le termofiline 9, 13 e 1277, gli unici con sequenza nota ad oggi. Tre coppie di primer sono stati disegnate ad hoc per rilevare tali determinanti e due dei tre geni, quelli per le termofiline 9 e la 13, sono stati individuati con differente frequenza nei ceppi della collezione. Nella terza parte della tesi sono stati studiati i tratti di antibiotico-resistenza dei ceppi di S. thermophilus della collezione, in particolare verso la tetraciclina. È stata valutata la presenza e l’espressione di tratti genici (geni tet) che conferiscono resistenza a questo antibiotico, la presenza di elementi genetici mobili in grado di trasferire i geni di resistenza e l’effettiva capacità di alcuni ceppi di S. thermophilus di trasmettere tale abilità anche ad altre specie batteriche, principalmente patogene e contaminanti, presenti negli alimenti. L’indagine dei geni tet ha mostrato la presenza, nei ceppi testati, di tre [tet(L), tet(M) e tet(S)] dei molti geni che conferiscono resistenza alla tetraciclina descritti in letteratura. Tutti i ceppi testati, tranne uno, recano il gene tet(S), metà dei ceppi reca tet(L) e qualche ceppo il gene tet(M). Oltre il 70% dei ceppi resistenti possiede due geni tet contemporaneamente. Dagli studi di espressione dei geni tet(L), tet(M) e tet(S) è emerso che tet(S) è sempre espresso, mentre gli altri due geni sono espressi solamente in alcuni dei ceppi in cui sono presenti. Lo studio della potenziale trasferibilità dei geni tet riscontrati, ha mostrato la presenza della famiglia di trasposoni Tn916-Tn1545 in concomitanza a tet(M), nonché la presenza di plasmidi di differenti dimensioni in alcuni dei ceppi analizzati. In questi plasmidi sono stati identificati per alcuni ceppi, il gene tet(S), per altri tet(M). Gli esperimenti di coniugazione allestiti verso un ceppo di S. thermophilus, uno di Enterococus faecalis e uno di Listeria innocua, non hanno mostrato, però, alcun evento di trasferibilità. Nell’ultima parte della tesi è stata valutata la presenza e l’espressione, da parte di S. thermophilus, di geni coinvolti nella produzione delle più importanti amine biogene, istamina e tiramina, e sono stati condotti studi per determinare la sequenza genica di tali determinanti. Alcuni ceppi della collezione sono risultati positivi per la presenza di geni codificanti istidina (hdec) e tirosina (tdec) decarbossilasi, coinvolti nella produzione di istamina e tiramina. L’espressione dei geni hdec e tdec è stata valutata con RT-PCR e Real Time RT-PCR in varie condizioni colturali. Sono state considerate la presenza e assenza nel mezzo di crescita di precursore in forma disponibile, la presenza di quantità limitate di zuccheri fermentescibili e l’aggiunta di sale. Dai dati ottenuti dagli esperimenti di RT-PCR, è risultato evidente che la presenza di precursore rappresenta un fattore fondamentale per una spiccata produzione delle due amine. La trascrizione dei geni è stata analizzata tramite Real Time RT-PCR ed è stata determinata la relativa produzione di amine in un mezzo colturale (Skim Milk) e condizioni di crescita che simulassero l’inizio di un processo produttivo caseario. Il gene hdec, nelle condizioni testate, è risultato sempre espresso, con un aumento della trascrizione del gene già dopo due ore dall’aggiunta di precursore al substrato. I livelli di trascrizione del gene tdec, invece, sono sempre abbastanza bassi, ed è stata riscontrata produzione di tiramina, in quantità elevate, solo dopo sette giorni di incubazione.

Food fermentation is the oldest biotechnological application and one of the cheaper and more efficient ways for the biopreservation of food products. It is also involved in many of the qualitative, organoleptic and nutritional properties of fermented products (taste, aroma, texture, consistency, availability of nutrients). The microorganisms that are mostly involved in food fermentation processes are lactic acid bacteria (LAB) and yeasts. In the dairy production, starters are cultures containing high amounts of LAB that are added to the milk in order to target the fermentation processes. The selected starter cultures most used in Italy consist mainly of thermophilic LAB, associations of different Streptococcus thermophilus biotypes or mixtures of S. thermophilus and other bacterial species. Even if the species S. thermophilus is genetically correlated to pathogenic species of the Streptococcus genus, it is safely used in food from many centuries. The non-pathogenicity of S. thermophilus is supported by its long-term safety use in foods (Iyer et al., 2010), by its “Generally Recognised As Safe” (GRAS) status declared by the Food and Drug Administration (FDA) in the USA and by its inclusion in the “Qualified Presumption of Safety” (QPS) list of the European Food Safety Authority (EFSA). In the last decades the European Community underlined the importance of a correct identification of the microorganisms used in food production and the need to verify the absence of hazard traits such as antibiotic resistances and the production of toxic compounds like biogenic amines. For this reason further studies are needed to better understand the positive and negative traits of S. thermophilus and its ability to adapt to different environmental and microbiological growth conditions. The present PhD project fits in this context and it has the purpose to evaluate the biodiversity, the antagonistic properties and the safety aspects of the species S. thermophilus. The first part of the research regards the identification and genetic typing of a collection of S. thermophilus strains, derived from the collections of different Italian research groups and isolated from dairy products of different type and geographical origin. The study of the intraspecific variability of the collected strains, obtained through a combination of different molecular techniques (specie-specific PCR, RAPD-PCR, RAPD-PCR combined with enzymatic restriction and plasmidic profiles) has allowed to establish the biodiversity among the strains and to detect some similarity groups. The results of this experiment represented the starting point for a wider study regarding this bacterial species. The second part of the doctoral thesis concerned the evaluation of the antagonistic activity of S. thermophilus strains towards other species used as starters or towards pathogens and contaminants. Some strains of the collection showed a higher activity than others, especially towards other starter species such as Streptococcus gallolyticus subsp. macedonicus, Lactobacillus delbruekii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus and other strains of S. thermophilus. Some strains also displayed an antagonistic activity towards Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Enterococcus faecium, even if in a lower extent respect those towards the other starters. Some chemico-physical features of the inhibitory substances and their production kinetic were also studied. The chemico-physical characterization of the molecules produced by the most performing strains was due to protein compounds with a size higher than 3 kDa, probably thermophilins. The produced thermophilins are thermoresistant, stable in a pH range from 2 to 7 and are produced at the beginning of the growth phase of the strains. The presence and diffusion of the genes coding for the thermophilins 9, 13 and 1277, the unique with known sequences till now, were also assessed. Three primer pairs were designed ad hoc to detect these determinants and two out of three genes, i.e. those for thermophilins 9 and 13, were found in the strains at different frequencies. The third part of the doctoral thesis regards the study of the antibiotic resistance traits in the S. thermophilus collection strains, and in particular the tetracycline resistance. This research includes the presence and expression of the genetic traits (tet genes) that confer resistance to this antibiotic, the presence of mobile genetic elements able to transfer resistance genes and the real ability of some strains to transfer antibiotic resistance to other food-borne bacterial species, especially pathogens and contaminants. The results showed the presence of three [tet(L), tet(M) and tet(S)] out of the many genes that give tetracycline resistance described in literature. All except one strains carried the tet(S) gene, half of the strains carried tet(L) and some strains tet(M). More than 70% of the resistant strains hold two tet genes at the same time. Expression studies of tet(L), tet(M) and tet(S) displayed that only tet(S) is always expressed while the other two genes are expressed only in some strains. The study of the transferability of the tet genes has revealed the presence of the Tn916-Tn1545 transposon family together with tet(M) gene, and the presence of plasmids of different sizes in some of the analysed strains. Such plasmids are found to carry the tet(S) or tet(M) gene. Conjugation trials conducted using as recipient strains of S. thermophilus, Enterococcus faecalis and Listeria innocua did not show gene transfer events. In the last part of the doctoral thesis the presence and expression of genes involved in the production of the most important biogenic amines, histamine and tyramine, were performed in S. thermophilus, and studies were conducted to determine the nucleotide sequence of these determinants. Some strains of the collection were positive for the presence of genes coding for hystidine (hdec) and tyrosine (tdec) decarboxylases, involved in the production of histamine and tyramine. The expression of hdec and tdec genes was evaluated by RT-PCR and Real-Time RT-PCR in different cultural conditions. The presence or not of the precursor in an available form in the growth media was considered, together with the occurrence of small amounts of fermentable sugars and the addition of salt. The data obtained from RT-PCR experiments displayed that the presence of the precursor can be a fundamental factor leading to an higher production of the two amines. Gene transcription, analysed by Real-Time RT-PCR, and amine production were determined in a cultural medium (Skim Milk) and in growth conditions that simulate the starting of a dairy production process. In the tested conditions, hdec gene was always expressed, with an increased expression just after two hours from the addition of the precursor to the substrate. On the contrary, the expression levels of the tdec gene were quite low and a high level tyramine production was observed only after seven days of incubation. To obtain the nucleotide sequence of the hdec and tdec genes of S. thermophilus different experimental strategies were followed: the design and use of new degenerated specific primers, also in combination with others already available in literature, and the setting up of Uneven PCR reactions (Chen & Wu, 1997). This multipurpose approach allowed to obtain the complete sequence of the hdec gene of the species S. thermophilus and the almost complete sequence of tdec gene. In conclusion, this doctoral thesis have deepen and understand some different aspects and characteristics of the species S. thermophilus and important innovative contributions were added to the knowledge of the species, in the view of its safe use in food.

Aspetti di sicurezza e proprietà antagonistiche di ceppi di Streptococcus thermophilus provenienti da prodotti caseari

LA GIOIA, Federica
2010-01-01

Abstract

Food fermentation is the oldest biotechnological application and one of the cheaper and more efficient ways for the biopreservation of food products. It is also involved in many of the qualitative, organoleptic and nutritional properties of fermented products (taste, aroma, texture, consistency, availability of nutrients). The microorganisms that are mostly involved in food fermentation processes are lactic acid bacteria (LAB) and yeasts. In the dairy production, starters are cultures containing high amounts of LAB that are added to the milk in order to target the fermentation processes. The selected starter cultures most used in Italy consist mainly of thermophilic LAB, associations of different Streptococcus thermophilus biotypes or mixtures of S. thermophilus and other bacterial species. Even if the species S. thermophilus is genetically correlated to pathogenic species of the Streptococcus genus, it is safely used in food from many centuries. The non-pathogenicity of S. thermophilus is supported by its long-term safety use in foods (Iyer et al., 2010), by its “Generally Recognised As Safe” (GRAS) status declared by the Food and Drug Administration (FDA) in the USA and by its inclusion in the “Qualified Presumption of Safety” (QPS) list of the European Food Safety Authority (EFSA). In the last decades the European Community underlined the importance of a correct identification of the microorganisms used in food production and the need to verify the absence of hazard traits such as antibiotic resistances and the production of toxic compounds like biogenic amines. For this reason further studies are needed to better understand the positive and negative traits of S. thermophilus and its ability to adapt to different environmental and microbiological growth conditions. The present PhD project fits in this context and it has the purpose to evaluate the biodiversity, the antagonistic properties and the safety aspects of the species S. thermophilus. The first part of the research regards the identification and genetic typing of a collection of S. thermophilus strains, derived from the collections of different Italian research groups and isolated from dairy products of different type and geographical origin. The study of the intraspecific variability of the collected strains, obtained through a combination of different molecular techniques (specie-specific PCR, RAPD-PCR, RAPD-PCR combined with enzymatic restriction and plasmidic profiles) has allowed to establish the biodiversity among the strains and to detect some similarity groups. The results of this experiment represented the starting point for a wider study regarding this bacterial species. The second part of the doctoral thesis concerned the evaluation of the antagonistic activity of S. thermophilus strains towards other species used as starters or towards pathogens and contaminants. Some strains of the collection showed a higher activity than others, especially towards other starter species such as Streptococcus gallolyticus subsp. macedonicus, Lactobacillus delbruekii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus and other strains of S. thermophilus. Some strains also displayed an antagonistic activity towards Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Enterococcus faecium, even if in a lower extent respect those towards the other starters. Some chemico-physical features of the inhibitory substances and their production kinetic were also studied. The chemico-physical characterization of the molecules produced by the most performing strains was due to protein compounds with a size higher than 3 kDa, probably thermophilins. The produced thermophilins are thermoresistant, stable in a pH range from 2 to 7 and are produced at the beginning of the growth phase of the strains. The presence and diffusion of the genes coding for the thermophilins 9, 13 and 1277, the unique with known sequences till now, were also assessed. Three primer pairs were designed ad hoc to detect these determinants and two out of three genes, i.e. those for thermophilins 9 and 13, were found in the strains at different frequencies. The third part of the doctoral thesis regards the study of the antibiotic resistance traits in the S. thermophilus collection strains, and in particular the tetracycline resistance. This research includes the presence and expression of the genetic traits (tet genes) that confer resistance to this antibiotic, the presence of mobile genetic elements able to transfer resistance genes and the real ability of some strains to transfer antibiotic resistance to other food-borne bacterial species, especially pathogens and contaminants. The results showed the presence of three [tet(L), tet(M) and tet(S)] out of the many genes that give tetracycline resistance described in literature. All except one strains carried the tet(S) gene, half of the strains carried tet(L) and some strains tet(M). More than 70% of the resistant strains hold two tet genes at the same time. Expression studies of tet(L), tet(M) and tet(S) displayed that only tet(S) is always expressed while the other two genes are expressed only in some strains. The study of the transferability of the tet genes has revealed the presence of the Tn916-Tn1545 transposon family together with tet(M) gene, and the presence of plasmids of different sizes in some of the analysed strains. Such plasmids are found to carry the tet(S) or tet(M) gene. Conjugation trials conducted using as recipient strains of S. thermophilus, Enterococcus faecalis and Listeria innocua did not show gene transfer events. In the last part of the doctoral thesis the presence and expression of genes involved in the production of the most important biogenic amines, histamine and tyramine, were performed in S. thermophilus, and studies were conducted to determine the nucleotide sequence of these determinants. Some strains of the collection were positive for the presence of genes coding for hystidine (hdec) and tyrosine (tdec) decarboxylases, involved in the production of histamine and tyramine. The expression of hdec and tdec genes was evaluated by RT-PCR and Real-Time RT-PCR in different cultural conditions. The presence or not of the precursor in an available form in the growth media was considered, together with the occurrence of small amounts of fermentable sugars and the addition of salt. The data obtained from RT-PCR experiments displayed that the presence of the precursor can be a fundamental factor leading to an higher production of the two amines. Gene transcription, analysed by Real-Time RT-PCR, and amine production were determined in a cultural medium (Skim Milk) and in growth conditions that simulate the starting of a dairy production process. In the tested conditions, hdec gene was always expressed, with an increased expression just after two hours from the addition of the precursor to the substrate. On the contrary, the expression levels of the tdec gene were quite low and a high level tyramine production was observed only after seven days of incubation. To obtain the nucleotide sequence of the hdec and tdec genes of S. thermophilus different experimental strategies were followed: the design and use of new degenerated specific primers, also in combination with others already available in literature, and the setting up of Uneven PCR reactions (Chen & Wu, 1997). This multipurpose approach allowed to obtain the complete sequence of the hdec gene of the species S. thermophilus and the almost complete sequence of tdec gene. In conclusion, this doctoral thesis have deepen and understand some different aspects and characteristics of the species S. thermophilus and important innovative contributions were added to the knowledge of the species, in the view of its safe use in food.
2010
Identificazione e tipizzazione genotipica; aspetti di sicurezza; antibiotico resistenze; amine biogene; proprietà antagonistiche; batteriocine; Streptococcus thermophilus; prodotti caseari
La fermentazione degli alimenti rappresenta la più antica applicazione biotecnologica e una delle più economiche ed efficienti forme di bioconservazione dei prodotti alimentari; è inoltre responsabile di molte delle proprietà qualitative, organolettiche e nutrizionali dei prodotti fermentati (gusto, aroma, struttura, consistenza, disponibilità di nutrienti). I microrganismi che maggiormente partecipano ai processi fermentativi alimentari sono i batteri lattici (LAB) e lieviti. Nell’ambito delle produzioni lattiero-casearie gli starter sono colture a elevata concentrazione di LAB che vengono aggiunte al latte da trasformare allo scopo di indirizzare i processi di fermentazione. Le colture starter selezionate di maggior impiego in Italia sono costituite in gran parte da LAB termofili, associazioni di differenti biotipi di Streptococcus thermophilus e miscele di S. thermophilus e altre specie batteriche. Nonostante la specie S. thermophilus sia correlata geneticamente alle specie patogene del genere Streptococcus, essa è utilizzata in modo sicuro da molti secoli nell’alimentazione umana. La non patogenicità di S. thermophilus è supportata, oltre che da una lunga storia di utilizzo sicuro nella produzione alimentare (Iyer et al., 2010), anche dal suo riconoscimento come “Generally Recognised As Safe” (GRAS) dalla Food and Drug Administration (FDA) negli Stati Uniti e dall’inclusione nella lista degli organismi facenti parte del sistema “Qualified Presumption of Safety” (QPS) dell’European Food Safety Authority (EFSA). Negli ultimi decenni la Comunità Europea ha sottolineato l’importanza di una corretta identificazione dei microrganismi impiegati nelle trasformazioni alimentari e la necessità di verificare che non rechino tratti pericolosi, come le antibiotico resistenze e la produzione di composti tossici per l’uomo, come le amine biogene. Per questo motivo sono necessari continui approfondimenti che chiariscano ulteriormente le potenzialità positive e negative di S. thermophilus, nonché la sua capacità di adattarsi alle condizioni ambientali e microbiologiche in cui sviluppa. In tale contesto si inserisce questo progetto di dottorato, che si è posto l’obiettivo di valutare la biodiversità, le caratteristiche di antagonismo ed alcuni aspetti di sicurezza legati alla specie S. thermophilus. La prima parte della ricerca ha avuto come oggetto l’identificazione e la tipizzazione genotipica di una collezione di ceppi appartenenti alla specie S. thermophilus, provenienti da collezioni di laboratorio di diversi gruppi di ricerca italiani e isolati da prodotti lattiero-caseari di diversa tipologia e provenienza geografica. Lo studio della variabilità intraspecifica dei ceppi collezionati, tramite l’applicazione combinata di più metodiche di biologia molecolare, quali PCR specie-specifica, RAPD-PCR, RAPD-PCR e restrizione enzimatica e analisi dei profili plasmidici, ha permesso di stabilire la biodiversità tra di essi e di individuare gruppi di similarità tra ceppi. Il lavoro svolto in questa sezione della tesi ha rappresentato il punto di partenza per affrontare uno studio più ampio di questa specie batterica. Nella seconda parte della tesi è stata valutata l’attività antagonistica di ceppi di S. thermophilus nei confronti di altre specie utilizzate come starter e nei confronti di specie patogene e contaminanti. Alcuni ceppi della collezione si sono distinti per un’attività più spiccata rispetto agli altri, in particolare verso altre specie starter come Streptococcus gallolyticus subsp. macedonicus, Lactobacillus delbruekii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus e altri ceppi di S. thermophilus. Alcuni ceppi hanno mostrato attività antagonistica anche verso Staphylococcus aureus, Escherichia coli ed Enterococcus faecium, anche se in misura minore rispetto all’attività riscontrata verso altri starter. Sono state inoltre studiate alcune caratteristiche chimico-fisiche dei composti con attività inibitoria, nonché la loro cinetica di produzione. La caratterizzazione chimico-fisica delle sostanze con attività inibitoria dei ceppi più performanti è risultata imputabile a composti proteici di dimensioni superiori a 3 Kda, probabilmente termofiline. Le termofiline prodotte sono tutte termoresistenti, stabili in un range di pH compreso tra 2 e 7 e prodotte già all’inizio della fase di crescita dei ceppi. È stata infine valutata la presenza e diffusione dei geni codificanti le termofiline 9, 13 e 1277, gli unici con sequenza nota ad oggi. Tre coppie di primer sono stati disegnate ad hoc per rilevare tali determinanti e due dei tre geni, quelli per le termofiline 9 e la 13, sono stati individuati con differente frequenza nei ceppi della collezione. Nella terza parte della tesi sono stati studiati i tratti di antibiotico-resistenza dei ceppi di S. thermophilus della collezione, in particolare verso la tetraciclina. È stata valutata la presenza e l’espressione di tratti genici (geni tet) che conferiscono resistenza a questo antibiotico, la presenza di elementi genetici mobili in grado di trasferire i geni di resistenza e l’effettiva capacità di alcuni ceppi di S. thermophilus di trasmettere tale abilità anche ad altre specie batteriche, principalmente patogene e contaminanti, presenti negli alimenti. L’indagine dei geni tet ha mostrato la presenza, nei ceppi testati, di tre [tet(L), tet(M) e tet(S)] dei molti geni che conferiscono resistenza alla tetraciclina descritti in letteratura. Tutti i ceppi testati, tranne uno, recano il gene tet(S), metà dei ceppi reca tet(L) e qualche ceppo il gene tet(M). Oltre il 70% dei ceppi resistenti possiede due geni tet contemporaneamente. Dagli studi di espressione dei geni tet(L), tet(M) e tet(S) è emerso che tet(S) è sempre espresso, mentre gli altri due geni sono espressi solamente in alcuni dei ceppi in cui sono presenti. Lo studio della potenziale trasferibilità dei geni tet riscontrati, ha mostrato la presenza della famiglia di trasposoni Tn916-Tn1545 in concomitanza a tet(M), nonché la presenza di plasmidi di differenti dimensioni in alcuni dei ceppi analizzati. In questi plasmidi sono stati identificati per alcuni ceppi, il gene tet(S), per altri tet(M). Gli esperimenti di coniugazione allestiti verso un ceppo di S. thermophilus, uno di Enterococus faecalis e uno di Listeria innocua, non hanno mostrato, però, alcun evento di trasferibilità. Nell’ultima parte della tesi è stata valutata la presenza e l’espressione, da parte di S. thermophilus, di geni coinvolti nella produzione delle più importanti amine biogene, istamina e tiramina, e sono stati condotti studi per determinare la sequenza genica di tali determinanti. Alcuni ceppi della collezione sono risultati positivi per la presenza di geni codificanti istidina (hdec) e tirosina (tdec) decarbossilasi, coinvolti nella produzione di istamina e tiramina. L’espressione dei geni hdec e tdec è stata valutata con RT-PCR e Real Time RT-PCR in varie condizioni colturali. Sono state considerate la presenza e assenza nel mezzo di crescita di precursore in forma disponibile, la presenza di quantità limitate di zuccheri fermentescibili e l’aggiunta di sale. Dai dati ottenuti dagli esperimenti di RT-PCR, è risultato evidente che la presenza di precursore rappresenta un fattore fondamentale per una spiccata produzione delle due amine. La trascrizione dei geni è stata analizzata tramite Real Time RT-PCR ed è stata determinata la relativa produzione di amine in un mezzo colturale (Skim Milk) e condizioni di crescita che simulassero l’inizio di un processo produttivo caseario. Il gene hdec, nelle condizioni testate, è risultato sempre espresso, con un aumento della trascrizione del gene già dopo due ore dall’aggiunta di precursore al substrato. I livelli di trascrizione del gene tdec, invece, sono sempre abbastanza bassi, ed è stata riscontrata produzione di tiramina, in quantità elevate, solo dopo sette giorni di incubazione.
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