Le encefalopatie spongiformi trasmissibili (EST) sono un gruppo di patologie neurodegenerative invariabilmente letali che si manifestano sia negli esseri umani che negli animali, causate da un agente trasmissibile la cui natura è in via di definizione. Ciononostante, le caratteristiche distintive di ciascun ceppo infettivo possono essere evidenziate e confrontate mediante passaggio sperimentale in una medesima specie di animali da laboratorio. Utilizzando questo approccio si è visto che il ceppo responsabile della variante di malattia di Creutzfeldt-Jakob (MCJv) umana è correlato direttamente all’encefalopatia spongiforme bovina e, grazie a questa acquisizione, sono state ottimizzate le misure profilattiche per bloccare la diffusione della malattia all’uomo. Questa osservazione ha dimostrato la possibilità di trasmissione zoonotica delle EST animali e ha spinto le autorità sanitare e la comunità scientifica a intensificare gli sforzi per definire le caratteristiche dei diversi ceppi naturali col fine ultimo di definire la loro storia epidemiologica, la loro virulenza e di comprendere eventuali correlazioni tra forme atipiche animali ed umane. Argomento della tesi di dottorato è la caratterizzazione dei ceppi associati ad alcuni casi italiani atipici di Malattia di Creutzfeldt-Jakob sporadica (MCJs) mediante trasmissione in topi transgenici che esprimono la proteina prionica umana omozigote per metionina (MM), per valina (VV), o eterozigote (MV) al codone polimorfico 129. I tre casi umani studiati, tutti con genotipo eterozigote in posizione 129 della proteina prionica, erano caratterizzati da particolari clinici inusuali (due di essi da esordio precoce, lunga durata della malattia e sintomi psichiatrici), o da un’inusuale biochimica (il terzo caso) a livello della proteina prionica patologica (assenza della forma ad alta glicosilazione). Le linee di topi transgenici originate mediante la tecnica del “gene targeting” posseggono il gene della proteina prionica umana nella corretta posizione all’ interno del genoma murino regolato dai corretti controlli di espressione. Questa modifica ha consentito di valutare le caratteristiche del ceppo in modo più approfondito rispetto a quanto è possibile fare con topi wild-type, permettendo di studiare la suscettibilità dei diversi genotipi umani (129 MM, VV, o MV) ai singoli ceppi prionici. I risultati hanno dimostrato che i primi due casi hanno trasmesso la patologia con elevata efficienza a tutti e tre i genotipi, con un tropismo particolare per i topi omozigoti per valina, che si ammalano con tempi inferiori del 50% rispetto agli altri genotipi. Il caso con glicosilazione difettiva ha mostrato bassissima patogenicità producendo malattia conclamata solo in alcuni dei topi omozigoti per valina. Il confronto dell’efficienza di infezione (animali ammalati/inoculati), dei tempi di incubazione, e dei profili neuropatologici e biochimici per la proteina prionica patologica tra i nostri animali e quelli di letteratura (inoculati con altre forme di CJD) ha mostrato che i nostri due casi con caratteristiche cliniche atipiche sono associati ad un ceppo infettante già noto, mentre il caso con glicosilazione atipica sembra appartenere ad un ceppo assolutamente originale e mai riscontrato in precedenza. Indagini più approfondite su questo caso sono in corso per comprendere la sua diffusione, pericolosità e gli eventuali rapporti con forme animali. Lo studio ha confermato il grande potenziale di queste linee transgeniche non solo per l’identificazione di nuovi ceppi che hanno un rischio infettivo sconosciuto per la popolazione, ma anche per indagare l’influenza del polimorfismo al codone 129 sulla suscettibilità dell’ospite e sul processo patologico delle malattie da prioni.

Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs) are fatal neurodegenerative diseases affecting humans and animals caused by a transmissible agent whose nature is still under debate. In spite of this uncertainty, the distinctive features of each infectious strain can be highlighted and compared through the experimental passage in a given species of laboratory animals. By using this approach, it was discovered that the strain responsible for variant Creutzfeldt-Jakob disease (vCJD) is directly related to the bovine spongiform encephalopathy infectious strain, thus helping to improve prophylactic measures to stop the spread of the disease. This observation proved the possibility of zoonotic transmission of animal TSEs and stimulated health authorities and researchers to intensify their efforts for the definition of strain properties with the aim to define their epidemiological history, their virulence and to understand possible correlations between atypical human and animal forms. The subject of my PhD thesis is the characterization of the strains associated to several atypical Italian cases of sporadic Creutzfeldt-Jakob Disease (sCJD) by the transmission in transgenic mice which express the human prion protein gene (PRNP) with three alternative genotypes at the polymorphic codon 129 (MM, MV, VV), the most recognised factor of susceptibility and pathological phenotype in sCJD. The three human cases analyzed, all heterozygous at position 129 of the prion protein, were characterized by unusual clinical signs (two of them, by an early onset, long duration of the disease and psychiatric symptoms), or by unusual biochemical properties for what concern the pathological prion protein (absence of the high glycosylated form). The three lines of transgenic mice, engineered by “gene targeting” technique, posses the human prion protein gene in the correct position within murine genome, under the strict control of natural expression modifiers. This genetic modification allowed to evaluate the “strain” characteristics and to study the susceptibility of the different human genotypes (129 MM, MV, VV) to the single prion strains. Results showed that the first two cases transmitted the disease to all three genotypes with an high efficiency, yet with a particular tropism towards the valine homozygous mice which were clinically sick with incubation times 50% shorter than mice expressing the other genotypes. The case with defective glycosylation displayed an exceedingly low attack rate, producing overt disease only in few, valine homozygous, mice. When comparing the efficiency of infection (sick animals/inoculated), the incubation times and the neurophatological and biochemical profiles, between our animals and their counterparts in the literature expressing identical PRNP genotypes but injected with other forms of sCJD, we observed that the two cases with atypical clinical features are associated to an infectious strain already known, whilst the case with atypical glycosylation seems to belong to an absolutely original strain, never found before. Concerning the latter case, further investigations are in course with the aim to understand its spread, its danger and its possible connection with animal forms. The study confirmed the relevant value of these transgenic lines, not only to identify new strains with an unknown pathogenic potential for humans, but also to investigate the influence of the polymorphic codon 129 on the host’s susceptibility and the pathological process of the prion diseases.

Characterization of human TSE strains after passage in humanized transgenic mice

GALENO, Roberta
2010-01-01

Abstract

Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs) are fatal neurodegenerative diseases affecting humans and animals caused by a transmissible agent whose nature is still under debate. In spite of this uncertainty, the distinctive features of each infectious strain can be highlighted and compared through the experimental passage in a given species of laboratory animals. By using this approach, it was discovered that the strain responsible for variant Creutzfeldt-Jakob disease (vCJD) is directly related to the bovine spongiform encephalopathy infectious strain, thus helping to improve prophylactic measures to stop the spread of the disease. This observation proved the possibility of zoonotic transmission of animal TSEs and stimulated health authorities and researchers to intensify their efforts for the definition of strain properties with the aim to define their epidemiological history, their virulence and to understand possible correlations between atypical human and animal forms. The subject of my PhD thesis is the characterization of the strains associated to several atypical Italian cases of sporadic Creutzfeldt-Jakob Disease (sCJD) by the transmission in transgenic mice which express the human prion protein gene (PRNP) with three alternative genotypes at the polymorphic codon 129 (MM, MV, VV), the most recognised factor of susceptibility and pathological phenotype in sCJD. The three human cases analyzed, all heterozygous at position 129 of the prion protein, were characterized by unusual clinical signs (two of them, by an early onset, long duration of the disease and psychiatric symptoms), or by unusual biochemical properties for what concern the pathological prion protein (absence of the high glycosylated form). The three lines of transgenic mice, engineered by “gene targeting” technique, posses the human prion protein gene in the correct position within murine genome, under the strict control of natural expression modifiers. This genetic modification allowed to evaluate the “strain” characteristics and to study the susceptibility of the different human genotypes (129 MM, MV, VV) to the single prion strains. Results showed that the first two cases transmitted the disease to all three genotypes with an high efficiency, yet with a particular tropism towards the valine homozygous mice which were clinically sick with incubation times 50% shorter than mice expressing the other genotypes. The case with defective glycosylation displayed an exceedingly low attack rate, producing overt disease only in few, valine homozygous, mice. When comparing the efficiency of infection (sick animals/inoculated), the incubation times and the neurophatological and biochemical profiles, between our animals and their counterparts in the literature expressing identical PRNP genotypes but injected with other forms of sCJD, we observed that the two cases with atypical clinical features are associated to an infectious strain already known, whilst the case with atypical glycosylation seems to belong to an absolutely original strain, never found before. Concerning the latter case, further investigations are in course with the aim to understand its spread, its danger and its possible connection with animal forms. The study confirmed the relevant value of these transgenic lines, not only to identify new strains with an unknown pathogenic potential for humans, but also to investigate the influence of the polymorphic codon 129 on the host’s susceptibility and the pathological process of the prion diseases.
2010
Transmissible Spongiform Encephalopathies; prion; Creutzfeldt-Jakob disease; transgenic mice.
Le encefalopatie spongiformi trasmissibili (EST) sono un gruppo di patologie neurodegenerative invariabilmente letali che si manifestano sia negli esseri umani che negli animali, causate da un agente trasmissibile la cui natura è in via di definizione. Ciononostante, le caratteristiche distintive di ciascun ceppo infettivo possono essere evidenziate e confrontate mediante passaggio sperimentale in una medesima specie di animali da laboratorio. Utilizzando questo approccio si è visto che il ceppo responsabile della variante di malattia di Creutzfeldt-Jakob (MCJv) umana è correlato direttamente all’encefalopatia spongiforme bovina e, grazie a questa acquisizione, sono state ottimizzate le misure profilattiche per bloccare la diffusione della malattia all’uomo. Questa osservazione ha dimostrato la possibilità di trasmissione zoonotica delle EST animali e ha spinto le autorità sanitare e la comunità scientifica a intensificare gli sforzi per definire le caratteristiche dei diversi ceppi naturali col fine ultimo di definire la loro storia epidemiologica, la loro virulenza e di comprendere eventuali correlazioni tra forme atipiche animali ed umane. Argomento della tesi di dottorato è la caratterizzazione dei ceppi associati ad alcuni casi italiani atipici di Malattia di Creutzfeldt-Jakob sporadica (MCJs) mediante trasmissione in topi transgenici che esprimono la proteina prionica umana omozigote per metionina (MM), per valina (VV), o eterozigote (MV) al codone polimorfico 129. I tre casi umani studiati, tutti con genotipo eterozigote in posizione 129 della proteina prionica, erano caratterizzati da particolari clinici inusuali (due di essi da esordio precoce, lunga durata della malattia e sintomi psichiatrici), o da un’inusuale biochimica (il terzo caso) a livello della proteina prionica patologica (assenza della forma ad alta glicosilazione). Le linee di topi transgenici originate mediante la tecnica del “gene targeting” posseggono il gene della proteina prionica umana nella corretta posizione all’ interno del genoma murino regolato dai corretti controlli di espressione. Questa modifica ha consentito di valutare le caratteristiche del ceppo in modo più approfondito rispetto a quanto è possibile fare con topi wild-type, permettendo di studiare la suscettibilità dei diversi genotipi umani (129 MM, VV, o MV) ai singoli ceppi prionici. I risultati hanno dimostrato che i primi due casi hanno trasmesso la patologia con elevata efficienza a tutti e tre i genotipi, con un tropismo particolare per i topi omozigoti per valina, che si ammalano con tempi inferiori del 50% rispetto agli altri genotipi. Il caso con glicosilazione difettiva ha mostrato bassissima patogenicità producendo malattia conclamata solo in alcuni dei topi omozigoti per valina. Il confronto dell’efficienza di infezione (animali ammalati/inoculati), dei tempi di incubazione, e dei profili neuropatologici e biochimici per la proteina prionica patologica tra i nostri animali e quelli di letteratura (inoculati con altre forme di CJD) ha mostrato che i nostri due casi con caratteristiche cliniche atipiche sono associati ad un ceppo infettante già noto, mentre il caso con glicosilazione atipica sembra appartenere ad un ceppo assolutamente originale e mai riscontrato in precedenza. Indagini più approfondite su questo caso sono in corso per comprendere la sua diffusione, pericolosità e gli eventuali rapporti con forme animali. Lo studio ha confermato il grande potenziale di queste linee transgeniche non solo per l’identificazione di nuovi ceppi che hanno un rischio infettivo sconosciuto per la popolazione, ma anche per indagare l’influenza del polimorfismo al codone 129 sulla suscettibilità dell’ospite e sul processo patologico delle malattie da prioni.
File in questo prodotto:
File Dimensione Formato  
Roberta Galeno-PhD tesi.pdf

accesso aperto

Tipologia: Tesi di dottorato
Licenza: Dominio pubblico
Dimensione 1.77 MB
Formato Adobe PDF
1.77 MB Adobe PDF Visualizza/Apri

I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11562/343521
Citazioni
  • ???jsp.display-item.citation.pmc??? ND
  • Scopus ND
  • ???jsp.display-item.citation.isi??? ND
social impact