Modulazione perossinitrito-dipendente delle vie di trasduzione MAP chinasiche nell’interazione pianta-patogeno

Durante lʼinterazione pianta-patogeno incompatibile, uno dei primi eventi che segna lʼinduzione della resistenza alla malattia e quindi della risposta ipersensibile (HR), è il rapido accumulo delle specie reattive dell"ossigeno (ROS), quali anione superossido (O2-) e perossido di idrogeno (H2O2), e dell"ossido nitrico (NO). LʼNO può reagire con lʼ O2- generando il perossinitrito (ONOO-), un potente ossidante in grado di reagire direttamente con le proteine portando alla nitrazione dei residui di tirosina. La nitrazione proteica è una modificazione post-traduzionale, che può alterare la conformazione, la struttura e lʼattività catalitica delle proteine nitrate. Un aumento del livello di proteine nitrate e lʼidentificazione di alcune proteine bersaglio di tale nitrazione è stato riportato in piante di Arabidopsis thaliana infettate con il patogeno avirulento, suggerendo un possibile ruolo fisiologico della nitrazione proteica durante la HR. La cascata delle MAP chinasi (MAPK), un sistema di trasduzione del segnale in grado di attivare una risposta cellulare in seguito ad uno stimolo esterno, è unʼaltra componente chiave della risposta di difesa delle piante. La trasmissione del segnale avviene attraverso fosforilazioni successive, che vengono finemente regolate per garantire la specificità della risposta cellulare, lungo una cascata lineare e direzionale che coinvolge le MAPKKK, le MAPKK e le MAPK. Poichè studi condotti su cellule animali hanno mostrato lʼimportanza della nitrazione proteica nella regolazione della cascata MAP chinasica, e, da esperimenti svolti precedentemente nel laboratorio del Prof. Delledonne, la MAPKK di tabacco, NtMEK2DD, è risultata nitrata ed inibita in seguito a trattamento con il ONOO- in vitro, allo scopo di capire se bersaglio della nitrazione nelle piante fossero le MAPKK, in questo lavoro di tesi, si è voluto indagare lʼeffetto del ONOO- su sei diverse MAPKK di A.thaliana. Si è quindi dimostrato che (i) la nitrazione è un processo selettivo in quanto tra le sei proteine in esame soltanto due, la AtMKK4 e la AtMKK9, sono risultate nitrate in seguito a trattamento con ONOO-; (ii) la nitrazione proteica non dipende dal numero di residui di tirosina presenti in quanto le AtMKK con il più alto numero di residui non sono risultate nitrate; e (iii) la conformazione potrebbe influenzare lʼaccessibilità dei residui tirosinici alla nitrazione in quanto la AtMKK5, che mostra unʼalta omologia di sequenza con la AtMKK4, non viene nitrata. Poichè la AtMKK4 è coinvolta nella risposta di difesa delle piante, si è deciso di analizzare lʼeffetto del ONOO- sulla sua attività. é stato dimostrato che la forma costitutivamente attiva, AtMKK4DE, trattata con ONOO- in vitro viene inibita. Inoltre, lʼidentificazione di 2 residui tirosinici nitrati situati in prossimità e allʼinterno del sito di legame dellʼATP, mediante spettrometria di massa, suggerisce che tale inibizione sia correlata allʼincapacità di AtMKK4DE nitrata di legare lʼATP. Infine, per confermare lʼinibizione mediata dal ONOO- della AtMKK4 in vivo, abbiamo dimostrato che il trattamento con ONOO- ritarda fortemente la morte cellulare indotta dalla sovraespressione di AtMKK4DE in foglie di tabacco. Concludendo, è interessante notare che, AtMKK5, nonostante mostri unʼalta omologia di sequenza con AtMKK4, non viene nitrata e la sua attività non viene compromessa in seguito a trattamento con il ONOO-, suggerendo che la ridondanza delle due proteine potrebbe essere compromessa dalla nitrazione durante lʼHR.

During an incompatible plant-pathogen interaction, the early events which play a key role in the activation of disease resistance are the accumulation of nitric oxide (NO) and the generation of the reactive oxygen species (ROS), such as the superoxide anion (O2-) and hydrogen peroxide (H2O2). NO can react with O2- to generate peroxynitrite (ONOO-), a potent oxidant able to react directly with proteins leading to the nitration of protein tyrosine residues. Tyrosine-nitration is a post-translational modification, which may alter conformation, structure and catalytic activity of nitrated proteins. An increase of Tyr-nitrated protein level and the identification of some of these targets have been previously reported in Arabidopsis thaliana plants challenged with an avirulent pathogen, suggesting a possible physiologically relevant role of nitration during the Hypersensitive Response (HR). The MAP kinase (MAPK) cascade, a signalling pathway able to transduce environmental changes in cellular responses, is other key component of plant defense response. Via a phosphorelay mechanism, which is fine regulated to guarantee the specificity of the cellular response, the MAPK cascade, minimally composed of a MAPKKK, a MAPKK and a MAPK, link upstream receptors to downstream targets. Since, in animals, Tyr-nitration has been reported to be relevant for MAPK cascade regulation, and previous data obtained in Prof. Delledonne laboratory, showed an effect of nitration on the activity of the tobacco MAPKK, NtMEK2, in this work, to understand if target of nitration in plant could be the MAPKK component, we analyzed the effect of ONOO- on six different MAPKK of A. thaliana (AtMKK). We demonstrated that (i) the Tyr nitration is a selective process since, among six MAPKK, only two, AtMKK4 and AtMKK9, were nitrated in vitro by ONOO-; (ii) the Tyr-nitration doesnʼt depend on the Tyr residue content in a protein, since the AtMKK with the highest number of Tyr residues were not nitrated; and (iii) the conformation could influence the accessibility of the Tyr residues to nitration, since the AtMKK5, which shows high homology with AtMKK4, was not nitrated. Since AtMKK4 is involved in plant defence, we also investigated in vitro the effect of ONOO- on the activity of the constitutively active form AtMKK4DE, and we demonstrated that it is inhibited. Moreover, the identification by mass spectrometry of two Tyr residues nitrated, located close and inside the ATP-binding site, suggest that this inhibition is correlated with the incapacity of nitrated AtMKK4DE to bind ATP. Then, to confirm the AtMKK4 inhibition by nitration in vivo, we showed that ONOO--treatment strongly delays AtMKK4DE-induced hypersensitive cell death in tobacco plants. Interestingly, AtMKK5, which shares high homology with AtMKK4, was not nitrated and its activity was not affected by ONOO--treatment, suggesting that AtMKK4 and AtMKK5 redundancy could be compromised by Tyr- nitration during the HR.