Genetic selection for flowering time traits during speciation of tomato

SINTESI Negli ultimi dieci anni, un network di informazioni sulla famiglia delle Solanacee è stato creato all’interno progetto internazionale SOL (International Solanaceae Genome Project), il cui scopo finale è quello di spiegare come un insieme comune di geni/proteine può portare a una vasta gamma di organismi morfologicamente e ecologicamente distinti come quelli della famiglia delle Solanacee. Questo taxon comprende più di 3000 specie, molte delle quali si sviluppano nella regione andina- amazzonica dell’America meridionale. Il loro habitat varia enormemente, dalle foreste pluviali ai deserti all’alta montagna. Inoltre, quella delle Solanacee è la terza famiglia economicamente più importante tra quelle in cui sono presenti specie coltivate, superata solo dai cereali (come riso, mais e grano) e dai legumi (come la soia), e la più importante tra le colture orticole. Essa comprende, tra gli altri, pomodoro, patata, melanzana, peperone, petunia e tabacco. Tra le solanacee, il pomodoro è stato scelto come riferimento, avendo un genoma diploide relativamente piccolo (950 Mb) per il quale sono disponibili linee pure omozigoti, oltre a un’avanzata mappa fisica basata su BAC utile per iniziare il sequenziamento. Esso offre inoltre il vantaggio di un ciclo vitale breve, della presenza di efficaci tecnologie di trasformazione, e della disponibilità di risorse genetiche e genomiche. In questo progetto, abbiamo unito strategie di genomica strutturale e funzionale, al fine di studiare nel pomodoro uno dei caratteri più importanti in termini di fitness e di adattamento: la fioritura. Abbiamo concentrato i nostri sforzi nello studio dei geni coinvolti nella via regolativa fotoperiodica, giacché alcune specie selvatiche di pomodoro, che crescono tra 0 e -25 gradi di latitudine e tra 0 e 3700 m di altitudine, mostrano risposte fotoperiodiche diverse. Questi geni sono membri di tre famiglie geniche, i cui ortologhi in Arabidopsis e riso svolgono un ruolo chiave nella regolazione della fioritura in dipendenza della lunghezza del giorno. Esse sono la famiglia genica dei TCOL (tomato CONSTANS-like), quella dei Criptocromi e quella di GIGANTEA. Nel capitolo 2 vengono fornite informazioni strutturali sull'organizzazione e sull'espressione di queste famiglie geniche nel pomodoro coltivato, e si analizza la microsintenia con Arabidopsis. Sono stati inoltre identificati quattro nuovi COL e un nuovo GIGANTEA. Nel capitolo 3 è stata analizzata la diversificazione a livello di sequenza delle tre famiglie di geni durante la speciazione nel clade pomodoro, utilizzando sia approcci di sequenziamento che analisi dei profili di espressione. In particolare, abbiamo osservato un alto grado di selezione diversificante per TCOL3, che presenta anche un cline geografico nella frequenza delle mutazioni sinonime, suggerendo un ruolo di questo gene nell’adattamento alle basse latitudini. Infine, nel capitolo 4, vengono usati quattro approcci di genetica inversa (VIGS, RNAi, TILLING e overespressione) per una caratterizzazione funzionale della famiglia genica dei Criptocromi di pomodoro. Nuovi mutanti cry1b- e cry2-, piante RNAi di CRY1b e CRY2 e overespressori di CRY1a sono descritti per la prima volta e nuovi fenotipi di sviluppo e fioritura sono attribuiti ai vari geni.

In the last decade, a coordinated network of knowledge about the Solanaceae family has been created by the International Solanaceae Genome Project (SOL), whose final purpose is to explain how a common set of genes/proteins can result in a wide range of morphologically and ecologically distinct organisms like those in the Solanaceae family. This taxon includes more than 3000 species many of which evolved in the Andean/Amazonian regions of South America. Their habitats vary dramatically, from rain forests to deserts to high mountains. Moreover, the Solanaceae is the third most valuable crop family exceeded only by the grasses (e.g. rice, maize, wheat) and legumes (e.g. soybean), and the most valuable in terms of vegetable crops. It includes, among others, tomato, potato, eggplant, pepper, petunia, tobacco. Among Solanaceae, tomato was selected as a reference since it provides the smallest diploid genome (950 Mb) for which homozygous inbreds are available, as well as an advanced BAC-based physical map to start the sequencing. It also offers the vantage of short generation time, routine transformation technology, and availability of rich genetic and genomic resources. In this project, we merged structural and functional genomic approaches, in order to study in tomato one of the most important characters in terms of fitness and adaptation: flowering. We have focused our efforts in the study of genes involved in the photoperiodic regulatory pathway, since some wild tomato species, that growth between 0 and -25 degrees of latitude and between 0 and 3700 m of elevation, show different photoperiodic responses. These genes are members of three gene families, whose orthologs in Arabidopsis and rice play a key role in the regulation of flowering in dependence of day length. They are the TCOL (tomato CONSTANS-like), the CRYPTOCHROME and the GIGANTEA gene families. In chapter 2 we provide structural information on the organization and expression of the CRY, COL and GI gene families in tomato and we analyse the microsynteny with Arabidopsis. We also identify four new COL and one new GI gene. In chapter 3 we investigate the sequence diversification of the three gene families during speciation in the tomato clade, using both sequencing and expression profiling approaches. In particular, we observed a high degree of diversifying selection for TCOL3, that presents also a geographical cline in the frequency of synonymous mutations, suggesting a role of this gene in adaptation to low latitudes. Finally, in chapter 4, we use four reverse genetic approaches (VIGS, RNAi, TILLING and overexpression) for a functional characterization of the tomato Cryptochrome gene family. Novel cry1b- and cry2- mutants and RNAi plants and CRY1a overexpressors are described for the first time and novel developmental and flowering phenotypes are attributed to the various genes.