Biochemical and structural characterization of calcium/calmodulin dependent glutamate decarboxylase 1 from Arabidopsis thaliana

La glutammico decarbossilasi (GAD) è un enzima piridossal-fosfato-dipendente che catalizza la decarbossilazione irreversibile dell’L-glutammato ad acido gamma-ammino butirrico (GABA), un aminoacido non proteico comunemente presente sia in procarioti che in eucarioti, successivamente metabolizzato a succinato da altri due enzimi: la GABA transaminasi e la succinico semialdeide deidrogenasi. La reazione di sintesi del GABA, che rappresenta il passaggio limitante della catena, insieme alle due reazioni di degradazione costituisce la via metabolica del GABA, cosiddetta GABA shunt. Rispetto alle GAD di altri organismi, le GAD vegetali possiedono una caratteristica unica: la presenza di un sito al C-terminale di legame per la calmodulina (CaM). Di conseguenza, l’attività delle GAD vegetali risulta dipendente dal livello citosolico di calcio (Ca2+). Il segnale mediato dal calcio è ampiamente utilizzato nelle piante per l’attivazione e la coordinazione di numerosi processi cellulari ed il fatto che la GAD sia stata inclusa in questo complessa rete di risposte probabilmente riflette una specializzazione funzionale del GABA negli organismi vegetali. Come conseguenza le GAD di pianta esibiscono una duplice regolazione, da pH, con un massimo di attività intorno a pH 5.8, e da calcio (Ca2+)/CaM con attivazione a pH neutro, trascurabile a pH acido. Lo studio in vitro delle implicazioni strutturali e funzionali di queste proprietà può restituire importanti informazioni circa il ruolo di queste proteine in vivo. Con questo obiettivo, ci si è pertanto rivolti ad uno studio di struttura e funzione per l’isoforma GAD1 di Arabidopsis thaliana e della sua regolazione dipendente dal complesso GAD1-CaM1. Mediante tecniche spettroscopiche di assorbimento UV-Vis e di fluorescenza è stato possibile ottenere informazioni significative sul micro-intorno del sito attivo di GAD1 e sui relativi effetti dovuti al legame della calmodulina. Inoltre, studi di mutagenesi sito-specifica del dominio C-terminale di GAD1 hanno permesso l’identificazione di residui chiave per la regolazione dell’enzima da calmodulina e da pH, dimostrando come questi due livelli di regolazione presentino basi molecolari comuni. Grazie alla collaborazione con il Dr Guido Capitani dell’Università di Zurigo è stata risolta la struttura tridimensionale di GAD1 nella sua forma ‘CaM- free’ a pH 6, a cui l’enzima presenta massima attività in assenza di calmodulina. La proteina è un omoesamero di 342 kDa composta da un trimero di dimeri, in cui ognuna delle unità monomeriche coordina una molecola di PLP. L’utilizzo della tecnica di Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) ha inoltre permesso di ottenere un modello a bassa risoluzione del complesso GAD1-CaM1, rivelando importanti informazioni strutturali riguardanti le modalità di legame della CaM. CaM1 è in grado di attivare GAD1 in maniera unica, rimuovendo due domini di auto-inibizione C-terminali di siti attivi adiacenti e formando un complesso GAD1-CaM1 di 393 kDa con una insolita stechiometria 1:3. Il complesso GAD1-CaM1 si presenta quindi come prototipo di un nuovo modo di interazione calmodulina-target, il cui comportamento ha permesso di chiarire ulteriormente il ruolo regolatore del dominio C-terminale delle GAD vegetali. Con l’obiettivo di descrivere la struttura quaternaria di GAD1 in soluzione, sono state analizzate le sue proprietà di associazione e dissociazione tramite l’utilizzo di tecniche spettroscopiche e cromatografiche. Studi di cromatografia ad esclusione molecolare (SEC) e di native PAGE hanno evidenziato che GAD1 esiste in soluzione in un equilibrio esamero-dimero dipendente da alcune specifiche condizioni, quali la concentrazione proteica, il pH e la concentrazione di NaCl. L’analisi del comportamento di GAD1 nelle diverse condizioni ha permesso la determinazione della costante di dissociazione (Kd) per l’esamero secondo il metodo di Manning [Manning et al., 1996]. La forte influenza del pH sulla capacità di GAD1 di associare ha suggerito che la formazione dell’esamero sia mediata principalmente da forze elettrostatiche. In particolare l’analisi della struttura tridimensionale di GAD1 ha evidenziato la presenza di una interazione ionica tra l’His15 e il Glu338 di unità dimeriche differenti, interazione interessante ai fini del processo di oligomerizzazione. Allo scopo di valutare il reale contributo di questa coppia ionica nell’influenzare l’equilibrio esamero-dimero di GAD1, è stato quindi creato e caratterizzato biochimicamente il doppio mutante H15LE338A. Sorprendentemente, il mutante ha mostrato un valore di Kd fortemente diminuito, almeno 50 volte inferiore rispetto a quello della proteina wt, accompagnato da una maggiore stabilità termica e da una più alta attività catalitica. La struttura 3D di GAD1 indica inoltre che i domini N-terminali giocano un ruolo importante nella formazione e stabilizzazione dell’esamero. La caratterizzazione di una versione troncata di GAD1, mancante dei primi 24 aminoacidi, ha confermato tale dato strutturale in quanto l’eliminazione di questo dominio N-terminale risulta nella completa dimerizzazione dell’enzima; inoltre il mutante mantiene attività decarbossilasica, ulteriore evidenza della natura dimerica dell’unità strutturale di base di GAD1. L’analisi basata su cromatografia ad esclusione molecolare di GAD1 wt e di tutti i suoi mutanti in presenza di Ca2+/CaM ha dimostrato come la calmodulina in tutti i casi si leghi con stechiometria 1:3, abolendo la dipendenza della struttura quaternaria di GAD1 wt sia dalla concentrazione proteica sia dal pH, suggerendo quindi una possibile ulteriore regolazione dell’enzima tramite oligomerizzazione. I dati biochimici e strutturali ottenuti hanno permesso di formulare un’ipotesi sul significato biologico della coesistenza dei due meccanismi di regolazione in GAD1, sottolineando la capacità dell’enzima di rispondere in maniera flessibile a diversi tipi di stress che si hanno nella cellula a differenti valori di pH.

Glutamate decarboxylase (GAD) is a pyridoxal 5´-phosphate (PLP)-dependent enzyme that catalyzes glutamate to γ-aminobutyrate (GABA) conversion. With respect to GADs from other organisms, plant GADs possess a unique feature, namely the presence of a C-terminal calmodulin (CaM) binding site. As a consequence, plant GADs exhibit dual regulation by pH, with maximum activity at pH 5.8 and by calcium (Ca2+)/CaM activation at neutral pH, nearly negligible at acidic pH. Herein, a detailed biochemical and structural description of the Arabidopsis thaliana enzyme GAD1 and of GAD1-CaM1 complex has been performed. A combination of UV/Vis spectrophotometry and fluorescence spectroscopy provided significant information on GAD1 active site and of its changes upon CaM1 binding. Importantly, mutagenesis studies allowed the identification of the key residues in the C-terminal region of GAD1 for regulation by calmodulin and by pH. Further, the crystal structure of Arabidopsis thaliana GAD1 in its CaM-free state at pH close to 6, where the enzyme reaches maximal turnover in the absence of CaM, was determinated. The protein is a 342-kDa homohexamer composed of a trimer of dimers, consisting of two layers of three subunits each, where the dimers contribute one subunit to each layer. A low-resolution structure of the calmodulin-activated GAD1 complex by Small-Angle X-ray Scattering (SAXS) was also obtained in order to elucidate the structure of the complex and the mode of activation. CaM1 activates GAD1 in a unique way by relieving two C-terminal autoinhibition domains of adjacent active sites, forming a 393 kDa GAD1-CaM1 complex with an unusual 1:3 stoichiometry, thus representing a prototype for a novel CaM target interaction mode. As an effort to elucidate GAD1 quaternary structure in solution, its dissociation/association and conformational properties were investigated by using an array of chromatographic and spectroscopic techniques. Size exclusion chromatography (SEC) and native PAGE clearly showed that GAD1 protein exists in a hexamer-dimer equilibrium in solution which is dependent on some specific conditions such as protein concentration, pH and NaCl concentration. The dissociation constant (Kd) for the hexamer under these different conditions was estimated according to the Manning method [Manning et al., 1996], adapted to the hexamer-dimer equilibrium. The strong influence of pH on GAD1 ability to associate suggested that electrostatic forces mediate hexamer formation. Inspection of GAD1 hexameric structure revealed the main contacts between the three dimers are set up by reciprocal salt bridges between His15 and Glu338. To investigate the importance of this ion pair contacts, H15LE338A double mutant was generated and biochemically characterized. Surprisingly, the mutant showed a Kd value strongly decreased, at least 50-fold lower than that of wild type (wt), with higher thermal stability and higher catalytic activity. The 3D structure of GAD1 indicates that N-terminal domain plays an important role in formation and stabilization of the hexamer. The truncation of GAD1 by removing the first 24 amino acid of the N-terminal domain resulted in the complete dimerization of the enzyme, confirming the N-terminal domain structural role in oligomerization. The deleted mutant retains decarboxylase activity, which is further evidence for the dimeric nature of the basic structural unit of GAD1. Interestingly Ca2+/CaM-binding essentially abolishes both protein concentration and pH dissociation dependence of GAD1 wt and of all its mutants forming and/or stabilizing a complex with a molecular weight in agreement with the 1:3 GAD1-CaM1 stoichiometry determinated by a SAXS solution study. An interpretation of the biological significance of the two coexisting regulation mechanisms of GAD1 was also proposed. Thanks to its two levels of regulation, GAD1 can respond flexibly to different kinds of cellular stress occurring at different pH values.