Grasping the proteome: detergents sub-fractionation of human and microbial cells leads to improvements in differential proteomics

La mia tesi di dottorato approfondisce aspetti relativi all’analisi proteomica in gel bidimensionale: il lavoro svolto si e’ proposto di apportare da un lato un contributo al miglioramento dei metodi di pre-frazionamento del campione, finalizzato al raggiungimento di un alto livello di risoluzione, ad una selezione di popolazioni di proteine più omogenee per la separazione su gel, e ad una migliore riproducibilità delle mappe proteiche, e dall’altro l’impiego dei protocolli messi a punto nella prima fase della ricerca e’ stato immediatamente trasferito e messo alla prova su due problematiche specifiche e selezionate di ambito sia microbiologico, che biomedico. L’applicazione dei protocolli di pre-frazionamento unitamente ad un disegno sperimentale di proteomica differenziale ha permesso di ricavare importanti informazioni biochimico-cellulari e di operare correlazioni stimolo-effetto. Gli obiettivi della tesi sono stati: 1) messa a punto di protocolli efficaci per la eliminazione di contaminanti (acidi nucleici e polisaccaridi) dal campione proteico per 2-DE; 2) indagine proteomica differenziale per delucidare i meccanismi molecolari dell’acido-resistenza di Ga. hansenii AAB248; 3) messa a punto di protocolli di frazionamento del campione in: proteine di membrana, del citosol e proteine associate alle membrane; 4) indagine sull’omeostasi del ferro nei macrofagi con approccio di proteomica differenziale: effetti della stimolazione con ferro ionico; 5) indagine sull’omeostasi del ferro nei macrofagi con approccio di proteomica differenziale: effetti della stimolazione con eritrociti senescenti. Proteomica microbiologica In collaborazione con il Dott. Giacomo Zapparoli, laboratorio di microbiologia, Dipartimento di Biotecnologie, Università di Verona e con il Prof. Paolo Giudici, Dipartimento di Scienze Agrarie, Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia. Proteomica biomedica In collaborazione con la Dott.ssa Annalisa Castagna e il Dott. Domenico Girelli, Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Unità di Medicina Interna B, Università di Verona, con la Dott.ssa Ivana De Domenico, Division of Hematology, Department of Medicine, School of Medicine, University of Utah, ed il Prof. Jerry Kaplan, Department of Pathology, School of Medicine, University of Utah.

Proteomics is an emerging area of science that attempts to study proteins on a massively parallel scale. It is by essence a multidisciplinary science: physics, chemistry, bioinformatics and mathematics join biochemistry, biology and medicine to solve general life science questions. Scientists worldwide are applying proteomic technology to solve problems which cannot be resolved by traditional methods, particularly in the biochemical field. Methodologically, proteomics is based on highly efficient methods of separation and analysis of proteins in living systems, which need to be continuously improved in order to achieve and maintain high resolution standards. Proteomics is considered a key technology in many biomedical sectors such as molecular medicine, drug discovery, clinical diagnostics, as well as microorganisms and plant studies. Shared problem in proteomic analysis is the great complexity of the samples, thus the proteomic technology needs improvements and new contributes to overcome the actual limitations in the samples treatment and recovery, to shorten and ease the recovery protocols, to affirm reproducibility and to effectively remove contaminants, in order to reach the degree of automation and cross-laboratory reproducibility collectively expected by the scientific community. The objectives of this thesis were both the development of protocols for protein recovery in order to achieve higher resolution and reproducibility in 2-DE, and at the direct applications of the set methods to the understanding of two selected and interesting proteomic cases. Concerning microbiological proteomics, we studied the molecular mechanism of acid-resistance in Ga. Hansenii; and concerning the biomedical proteomics, the molecular basis of iron homeostasis in macrophages was studied. The thesis work was performed at the Biochemical Methodology and Proteomics laboratory of Department of Biotechnology of the University of Verona, in collaboration with other laboratories. Regarding the study on macrophages, we collaborated with Dr. Annalisa Castagna and Prof. Domenico Girelli, Unit of Internal Medicine B, Department of Clinical and Experimental Medicine of the University of Verona, with Dr. Ivana De Domenico, Division of Hematology, Department of Medicine, School of Medicine, University of Utah, and Prof. Jerry Kaplan, Department of Pathology, School of Medicine, University of Utah, and with Dr. Anna Maria Timperio and Prof. Lello Zolla, Department of Ambiental Science, University of “La Tuscia”, Viterbo. Regarding the study on Ga. hansenii we collaborated with Dr. Giacomo Zapparoli, Department of Biotechnology of the University of Verona and with Prof. Paolo Giudici, Department of Agricultural and Food Science, University of Modena and Reggio Emilia.