Lo studio eseguito in questo progetto di ricerca ha avuto come scopo quello di definire in che modo vengano specificati i diversi tipi cellulari durante lo sviluppo del tubo neurale nel pesce zebrafish (Danio rerio), un piccolo teleosteo della famiglia dei Ciprinidi utilizzato come organismo modello. Oggetto dello studio sono stati i geni Olig, essenziali per la formazione e il corretto sviluppo di vari tipi cellulari del SNC, quali interneuroni, motoneuroni, oligodendrociti e astrociti, e di una struttura unica nei vertebrati, le creste neurali. Negli amnioti sono noti tre membri Olig, mentre in pesci ed anfibi sono stati identificati quattro membri: olig1, olig2, olig3 ed olig4. In questo studio inoltre, è stata fatta un’analisi microarray per identificare i bersagli molecolari controllati dal fattore trascrizionale olig4. Sono così emersi una serie di geni legati all’inattivazione di questo fattore di trascrizione che ci hanno offerto una visione più ampia di quella che potrebbe essere la via regolativa nello sviluppo del SNC e la funzione di olig4 nel limitare lo sviluppo delle creste neurali. L’utilizzo di un mutante genetico per olig4 sta ora confermando i risultati precedentemente osservati durante l’analisi microarray; la conferma su alcuni dei geni più interessanti e’ giunta da esperimenti di ibridazione in situ. E’ stato inoltre clonato un altro membro della famiglia olig in zebrafish, nominato olig3 in base a comparazione filogenetica (Bronchain et al., 2007). Dall’analisi del membro olig3 tramite ibridazione in situ è emerso che la somma dei profili d’espressione dei geni olig3 ed olig4, (le sequenze dei quali presentano significativa similarità) ricapitola il profilo d’espressione del gene Olig3 in topo (ove il membro Olig4 non è stato tuttora individuato). In seguito al clonaggio di questo nuovo membro, ne è stato esaminato il profilo d’espressione in relazione agli altri membri della famiglia genica e ad alcuni marcatori del tubo neurale. Una volta chiariti i rapporti spaziali di espressione fra i quattro membri della famiglia olig, si è potuta effettuare un’analisi basata su trattamenti con inibitori specifici per alcune vie di segnale paracrino implicate nello sviluppo del SNC di zebrafish. Tale analisi ha potuto chiarire la regolazione dei diversi membri della famiglia olig da parte dei gradienti morfogenetici che regolano le prime fasi dello sviluppo. Un’altra serie di risultati riguarda un lavoro svolto sul gene moonshine (mon) di zebrafish, che codifica per la proteina Trim33, responsabile dell’ematopoiesi nell’adulto. Il prodotto del gene mon in zebrafish è in relazione con vari co-attivatori e co-repressori appartenenti alla via di segnale del TGF-beta. Nel corso di questa ricerca è stato trattato il mutante genetico moonshine (allele tg234) con una sostanza chimica inibitrice del segnale TGF-beta in grado di fenocopiare in vivo il mutante genetico per questa importante via di sviluppo. In seguito a tale trattamento, è stato ottenuto un recupero dell’espressione di gata1 nei precursori delle cellule ematopoietiche di zebrafish, come verificato da esperimenti di ibridazione in situ. Questo risultato ha permesso di capire come il gene mon sia coinvolto a monte della via TGF-beta nel processo emopoietico di zebrafish.

Studies performed in this research are aimed to define how different cell types are specified during neural development of the model organism zebrafish (Danio rerio), a little teleost fish of Cyprinid family. Investigations involved the analysis of Olig genes, a family of transcriptional factors important for development and determination of different cell types of CNS (Central Nervous System), such as interneurons, motoneurons, oligodendrocytes, astrocytes, and neural crest cells, a structure that is unique of vertebrates. Phylogenetic comparisons (Bronchain et al., 2007) identified three Olig members in amniotes, while in fishes and amphibians four members were isolated: olig1, olig2, olig3 and olig4. Moreover, this project dealt with a microarray analysis to identify molecular targets controlled by the transcriptional factor olig4. So, this led to the identification of a group of genes related to the inactivation of this transcriptional factor that offered a wide image on possible regulatory patterns involved in CNS development, and on possible olig4 function in limiting neural crest development. The availability of an olig4 genetic mutant is now confirming results already observed during microarray analysis and further evidences are coming from in situ hybridization staining using a group of target genes. An additional member of the olig family has been cloned in zebrafish and it has been named olig3 on the basis of phylogenetic comparisons (Bronchain et al., 2007). In zebrafish, olig3 in situ hybridization staining analysis revealed that expression patterns of olig3 and olig4 (which sequences show a high level of similarity), together correspond to the expression pattern of murine Olig3 (an homologue of olig4 in mouse has not yet been identified). In this study, the zebrafish olig3 gene has been cloned and its expression pattern compared with that of some neural tube markers and other members of the olig family, to elucidate inter-reciprocal position of expression domains. Analysis have been performed based on treatments with specific inhibitors of some paracrine signaling pathways involved in zebrafish CNS development. This analysis allowed focusing on regulatory pathways of olig family members controlled by morphogenetic gradients during early embryonic development. Furthermore, this research project involved a study on zebrafish moonshine (mon) gene. This gene codifies for Trimm33, a protein implicated in adult hematopoiesis. Zebrafish mon gene product is related to different co-activators an co-repressors of the TGF-beta signaling pathway. In this study, genetic moonshine mutants (montg234) were treated with an artificial inhibitor of TGF-beta signaling pathway that allows reproducing in vivo the phenotype of genetic mutants for this important signaling pathway. The effect obtained after the treatment showed in zebrafish a restored expression of haematopoietic precursor markers such as gata1 and this was confirmed through in situ hybridization staining. Results added insight on mon involvement upstream TGF-beta signals in zebrafish haematopoietic pathway.

Lo zebrafish come strumento per lo studio integrato di segnali endocrini e paracrini che regolano le prime fasi dello sviluppo tissutale. (Doctoral Thesis)

MODENA, Nicola
2008-01-01

Abstract

Studies performed in this research are aimed to define how different cell types are specified during neural development of the model organism zebrafish (Danio rerio), a little teleost fish of Cyprinid family. Investigations involved the analysis of Olig genes, a family of transcriptional factors important for development and determination of different cell types of CNS (Central Nervous System), such as interneurons, motoneurons, oligodendrocytes, astrocytes, and neural crest cells, a structure that is unique of vertebrates. Phylogenetic comparisons (Bronchain et al., 2007) identified three Olig members in amniotes, while in fishes and amphibians four members were isolated: olig1, olig2, olig3 and olig4. Moreover, this project dealt with a microarray analysis to identify molecular targets controlled by the transcriptional factor olig4. So, this led to the identification of a group of genes related to the inactivation of this transcriptional factor that offered a wide image on possible regulatory patterns involved in CNS development, and on possible olig4 function in limiting neural crest development. The availability of an olig4 genetic mutant is now confirming results already observed during microarray analysis and further evidences are coming from in situ hybridization staining using a group of target genes. An additional member of the olig family has been cloned in zebrafish and it has been named olig3 on the basis of phylogenetic comparisons (Bronchain et al., 2007). In zebrafish, olig3 in situ hybridization staining analysis revealed that expression patterns of olig3 and olig4 (which sequences show a high level of similarity), together correspond to the expression pattern of murine Olig3 (an homologue of olig4 in mouse has not yet been identified). In this study, the zebrafish olig3 gene has been cloned and its expression pattern compared with that of some neural tube markers and other members of the olig family, to elucidate inter-reciprocal position of expression domains. Analysis have been performed based on treatments with specific inhibitors of some paracrine signaling pathways involved in zebrafish CNS development. This analysis allowed focusing on regulatory pathways of olig family members controlled by morphogenetic gradients during early embryonic development. Furthermore, this research project involved a study on zebrafish moonshine (mon) gene. This gene codifies for Trimm33, a protein implicated in adult hematopoiesis. Zebrafish mon gene product is related to different co-activators an co-repressors of the TGF-beta signaling pathway. In this study, genetic moonshine mutants (montg234) were treated with an artificial inhibitor of TGF-beta signaling pathway that allows reproducing in vivo the phenotype of genetic mutants for this important signaling pathway. The effect obtained after the treatment showed in zebrafish a restored expression of haematopoietic precursor markers such as gata1 and this was confirmed through in situ hybridization staining. Results added insight on mon involvement upstream TGF-beta signals in zebrafish haematopoietic pathway.
2008
Zebrafish; segnali endocrini e paracrini; sviluppo
Lo studio eseguito in questo progetto di ricerca ha avuto come scopo quello di definire in che modo vengano specificati i diversi tipi cellulari durante lo sviluppo del tubo neurale nel pesce zebrafish (Danio rerio), un piccolo teleosteo della famiglia dei Ciprinidi utilizzato come organismo modello. Oggetto dello studio sono stati i geni Olig, essenziali per la formazione e il corretto sviluppo di vari tipi cellulari del SNC, quali interneuroni, motoneuroni, oligodendrociti e astrociti, e di una struttura unica nei vertebrati, le creste neurali. Negli amnioti sono noti tre membri Olig, mentre in pesci ed anfibi sono stati identificati quattro membri: olig1, olig2, olig3 ed olig4. In questo studio inoltre, è stata fatta un’analisi microarray per identificare i bersagli molecolari controllati dal fattore trascrizionale olig4. Sono così emersi una serie di geni legati all’inattivazione di questo fattore di trascrizione che ci hanno offerto una visione più ampia di quella che potrebbe essere la via regolativa nello sviluppo del SNC e la funzione di olig4 nel limitare lo sviluppo delle creste neurali. L’utilizzo di un mutante genetico per olig4 sta ora confermando i risultati precedentemente osservati durante l’analisi microarray; la conferma su alcuni dei geni più interessanti e’ giunta da esperimenti di ibridazione in situ. E’ stato inoltre clonato un altro membro della famiglia olig in zebrafish, nominato olig3 in base a comparazione filogenetica (Bronchain et al., 2007). Dall’analisi del membro olig3 tramite ibridazione in situ è emerso che la somma dei profili d’espressione dei geni olig3 ed olig4, (le sequenze dei quali presentano significativa similarità) ricapitola il profilo d’espressione del gene Olig3 in topo (ove il membro Olig4 non è stato tuttora individuato). In seguito al clonaggio di questo nuovo membro, ne è stato esaminato il profilo d’espressione in relazione agli altri membri della famiglia genica e ad alcuni marcatori del tubo neurale. Una volta chiariti i rapporti spaziali di espressione fra i quattro membri della famiglia olig, si è potuta effettuare un’analisi basata su trattamenti con inibitori specifici per alcune vie di segnale paracrino implicate nello sviluppo del SNC di zebrafish. Tale analisi ha potuto chiarire la regolazione dei diversi membri della famiglia olig da parte dei gradienti morfogenetici che regolano le prime fasi dello sviluppo. Un’altra serie di risultati riguarda un lavoro svolto sul gene moonshine (mon) di zebrafish, che codifica per la proteina Trim33, responsabile dell’ematopoiesi nell’adulto. Il prodotto del gene mon in zebrafish è in relazione con vari co-attivatori e co-repressori appartenenti alla via di segnale del TGF-beta. Nel corso di questa ricerca è stato trattato il mutante genetico moonshine (allele tg234) con una sostanza chimica inibitrice del segnale TGF-beta in grado di fenocopiare in vivo il mutante genetico per questa importante via di sviluppo. In seguito a tale trattamento, è stato ottenuto un recupero dell’espressione di gata1 nei precursori delle cellule ematopoietiche di zebrafish, come verificato da esperimenti di ibridazione in situ. Questo risultato ha permesso di capire come il gene mon sia coinvolto a monte della via TGF-beta nel processo emopoietico di zebrafish.
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