Cardioprotective Role of Endogenous UrocortinIn the Human Heart Exposed to Cardioplegic Arrest and Reperfusion

Poiché la prevalenza della malattia coronarica continua ad aumentare, si assiste ad una richiesta crescente di procedure di rivascolarizzazione, tra cui la rivascolarizzazione chirurgica eseguita “on pump”, durante la quale il cuore viene inevitabilmente esposto ad un danno iatrogenico da ischemia/riperfusione, a seguito dell’arresto cardioplegico e successiva riperfusione. Le cellule miocardiche muoiono conseguentemente a vari meccanismi, tra cui l'apoptosi, l’oncosi e l’autofagia, ciascuno dei quali puo’ esitare in necrosi. Anche se le soluzioni cardioplegiche sono state studiate e sviluppate per minimizzare il danno iatrogenico indotto dall’arresto cardioplegico seguito da reperfusione, l’individuazione e l'utilizzazione di fattori endogeni come l’urocortina (Ucn) rimane auspicabile allo scopo di migliorare la protezione del miocardio. L’Ucn e’ un polipeptide endogeno formato da 40 aminoacidi, originariamente isolato dal mesencefalo di ratto e successivamente isolato in vari organi ed apparati tra cui il cuore. L’Ucn viene rilasciata dai cardiomiociti esposti ad ischemia ed esercita cardioprotezione con meccanismo autocrino e paracrino. Il nostro lavoro di tesi si articola attraverso tre fasi sperimentali. Nella prima serie di esperimenti abbiamo investigato il potenziale clinico dell’Ucn come biomarker per la diagnosi di ischemia miocardica sub-letale. Abbiamo valutato il rilascio dell’Ucn nel perfusato di cuore di ratti Sprague-Dawley esposti a periodi crescenti di ischemia globale a flusso zero, seguiti da un periodo fisso di riperfusione. Valutazioni analoghe sono state eseguite nella circolazione di ratti Sprague-Dawley esposti in vivo a periodi identici di ischemia regionale e riperfusione. Il più alto rilascio di Ucn sia nel perfusato che nel plasma è stato documentato dopo 5 e 10 minuti di ischemia, quando il recupero funzionale post-ischemico era completo e non c'era né apoptosi, né rilascio di biomarcatori convenzionali di necrosi cardiaca, come ad esempio la CPK. Abbiamo documentato che l'ischemia cardiaca provoca il rilascio di Ucn prima che avvenga la morte delle cellule cardiache ed indipendentemente dalla morte cellulare. I livelli di Ucn aumentano dopo 5 minuti di ischemia e raggiungono un picco dopo 10 minuti di ischemia, quando la morte cellulare non è stata rilevata. Tuttavia, dopo intervalli più lunghi, come 20 e 30 minuti di ischemia, l'apoptosi e/o la necrosi dei miociti si associano ad un concomitante calo dei livelli di Ucn, suggerendo che l'espressione e il rilascio di Ucn sono prevalentemente sostenuti da miociti che sono metabolicamente sofferenti, anche se ancora vitali. Inoltre, a differenza dei marcatori biochimici correnti, come la troponina cardiaca e la CPK, che aumentare consequentemente alle manipolazioni chirurgiche, il rilascio nel siero di Ucn non viene influenzato ne’ dall’anestesia ne’ dall’intervento chirurgico per se’. Pertanto, in pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca, la misurazione dell’Ucn ematica può aiutare ad identificare il danno ischemico cardiaco peri- e post-operatorio. Nella seconda serie di esperimenti abbiamo studiato il ruolo cardioprotettivo dell’Ucn in pazienti sottoposti a bypass aortocoronarico, ed il suo meccanismo di azione a riguardo della espressione, attivazione e trasferimento della PKCε. Due biopsie sequenziali sono state ottenute dall’atrio destro di 25 pazienti sottoposti a bypass coronarico sia all'inizio del grafting (controllo interno) che 10 minuti dopo il rilascio del clampaggio aortico. Il danno iatrogeno da ischemia/reperfusione induce un aumento selettivo dei messaggeri e della proteine della PKCε, la cui attivazione fosforilativa aumenta di ben 2.9 volte. La traslocazione mitocondriale della PKCε attivata è stata osservata solo dopo l’arresto cardioplegico mediante metodiche di frazionamento subcellulare ed immunostaining. L’aumentata espressione e rilocazione mitocondriale della PKCε è stata solo osservata nei miociti vitali, che presentano positività per l’Ucn. Infine, gli esperimenti di coimmunoprecipitazione hanno dimostrato come l’ischemia/riperfusione iatrogena comporti interazione fisica della PKCε attivata con la subunità 6.1 dei canali del potassio (KATP channels). L’espressione selettiva dell’Ucn nelle cellule vitali che presentano allo stesso tempo aumentata espressione e rilocazione mitocondriale della PKCε, suggerisce un ruolo cardioprotettivo per l’Ucn endogena. L'interazione fisica della PKCε attivata con la subunita’ 6.1 dei canali del potassio, stimolata dall’arresto cardioplegico, può rappresentare un possibile meccanismo di cardioprotezione esercitato dall’Ucn. Nella terza serie di esperimenti abbiamo esplorato il ruolo dell’Ucn e delle isoforme PKCε e PKCδ in pazienti diabetici sottoposti a bypass coronarico. Oltre ad indurre stress ossidativo e a deprimere la contrattilita’ miocardica, l’iperglicemia induce disfunzione mitocondriale, rilascio di citocromo c ed apoptosi mediante attivazione degli isoenzimi della PKC. L'attivazione della PKCδ, un altro isoenzima della PKC ad azione proapoptotica, è stata segnalata in miociti ventricolari in condizioni di iperglicemia. Abbiamo condotto esperimenti riguardanti l’espressione di Ucn, PKCε e PKCδ in biopsie atriali prelevate all’inizio dell’arresto cardioplegico (controllo interno) e 10 minuti dopo il rilascio del clampaggio aortico da 27 pazienti diabetici e 22 pazienti non diabetici sottoposti a bypass aortocoronarico in pompa. L'induzione dell’Ucn è stata documentata sia a livello di RNA messaggero che di livello proteico nei campioni atriali provenienti da cuori di pazienti non diabetici. Al contrario, nei cuori di pazienti diabetici i livelli pre-cardioplegici di Ucn erano inferiori al 50% rispetto a cuori non diabetici, mentre la induzione post- cardioplegica dell’Ucn non è stata osservata. Nei cuori diabetici, i livelli pre-cardioplegici di PKCε erano del 30% inferiori a quelli dei cuori non diabetici, e l'arresto cardioplegico non era associato ad aumentata espressione degli RNA messaggeri della PKCε. L’espressione e l’attivazione fosforilativa della PKCε a loro volta non vengono modificate dall’arresto cardioplegico. Al contrario, nei cuori diabetici vi era induzione della PKCδ sia a livello di RNA messaggero che di proteina totale, nonche’ attivazione fosforilativa della stessa PKCδ. La rilocazione mitocondriale della PKCε è stata principalmente rilevata nei campioni postcardioplegici prelevati dai cuori non diabetici, mentre la traslocazione nucleare e mitocondriale della PKCδ è stata documentata soprattutto nei campioni post-cardioplegici provenienti dai cuori diabetici. L'apoptosi, valutata per mezzo della colorazione TUNEL, è 2 volte più alta nei cuori dei pazienti diabetici (6.5±1.8%) rispetto ai non-diabetici (2.9±0.7%). Attivazione e rilocazione mitocondriale della PKCε è stata osservata soprattutto nei miociti vitali che esibiscono positività per l’Ucn. Pertanto, l'apoptosi miocitaria viene prevenuta dalla rilocazione mitocondriale della PKCε attivata. Nelle cellule cardiache che esibiscono positività citoplasmatica per l’Ucn, la traslocazione nucleare della PKCδ non e’ mai stata osservata. Al contrario, i miociti che presentano trasferimento nucleare della PKCδ erano TUNEL-positivi e sistematicamente negativi per l’Ucn. Pertanto, l'apoptosi dei miociti viene prevenuta dalla traslocazione nucleare e mitocondriale della PKCδ. In conclusione, abbiamo osservato che nei cuori diabetici, l’arresto cardioplegico non induce l’espressione miocitaria delUcn, la cui assenza è stata associata con l'induzione, l'attivazione, il trasferimento nucleare e mitocondriale della PKC δ, che esita finalmente in apoptosi. Pertanto, la mancata induzione delUcn può rendere il cuore diabetico più sensibile alla apoptosi e contribuire ad incrementare l’incidenza delle complicazioni postchirurgiche nei pazienti diabetici.

As the prevalence of coronary heart disease grows, there is an increasing need for revascularization, including surgical revascularization on cardiopulmonary bypass during which the heart is exposed to iatrogenic ischemia / reperfusion injury (IRI) as a result of cardioplegic arrest and subsequent reperfusion. Subsequent cell death by various mechanisms (apoptosis, oncosis, and autophagy, all of which may result in necrosis) may occur, with some features of each type observed in IRI. Although cardioplegic solutions remain the cornerstone of myocardial protection, identification and utilization of endogenous elements such as Urocortin (Ucn), may provide additional protection. Urocortin is an endogenous polypeptide comprised of forty amino acids. Originally isolated from the rat midbrain and subsequently isolated in other organs including the heart, Ucn is released by cardiac cells exposed to ischemia and provides cardioprotection with an autocrine and paracrine mechanism. Our thesis work consists of three experimental phases. In the first set of experiments, we explored the potential clinical utility of Ucn as a biomarker of myocardial ischemia. We performed assays of Ucn on the perfusate of Langendorff-perfused Sprague–Dawley rat hearts exposed to increasing periods of zero-flow global ischemia followed by reperfusion, as well as Ucn assays in the circulation of Sprague–Dawley rats exposed in vivo to identical periods of regional ischemia and reperfusion. The highest release of Ucn into both perfusate and plasma was documented after 5 and 10 minutes of ischemia, when the post-ischemic functional recovery was complete and there was neither myocyte apoptosis nor release of conventional biomarkers of cardiac necrosis, such as CPK, as compared to longer ischemic intervals of 20 and 30 minutes when myocyte apoptosis and/or necrosis occurred along with a concurrent decline in Ucn levels, suggesting that Ucn expression and release are mainly sustained by metabolically challenged, though still viable myocytes. In addition, unlike the current biochemical markers, such as cardiac troponin and CPK, which may be elevated as a consequence of iatrogenic injury from the surgery itself, serum Ucn was unaffected either by anaesthesia or surgery. Thus, serum Ucn levels may help in the identification of peri- and post-operative cardiac injury. In the second set of experiments, we investigated the cardioprotective role of Ucn in patients undergoing cardiac surgery, and its mechanism of action with respect to protein kinase C epsilon (PKC ε) expression, activation, and relocation. Two sequential biopsies were obtained from the right atrium of 25 patients undergoing coronary artery bypass grafting at the start of grafting (internal control) and 10 minutes after release of the aortic clamp. In hearts exposed to iatrogenic ischemia/reperfusion injury, Ucn induction was documented at both the mRNA and the protein levels, along with a selective increase of protein kinase C ε mRNA, over-expression of total protein kinase C ε, and increase in protein kinase C ε phosphorylation. Mitochondrial translocation of activated protein kinase C ε was observed only in post cardioplegic samples, using both subcellular fractionation and immunostaining techniques. Enhanced protein kinase C ε/mitochondria colocalization was observed in viable myocytes, which also stained positive for Ucn. Finally, using coimmunoprecipitation, an iatrogenic ischemia/reperfusion injury-enhanced physical interaction of phosphorylated protein kinase C ε with the 6.1 inwardly rectifying potassium channel subunit (Kir 6.1) of the KATP channels. After iatrogenic ischemia/reperfusion injury, Ucn expression in viable cells selectively co-localized with enhanced phosphorylation and mitochondrial relocation of protein kinase C ε, suggesting a cardioprotective role for endogenous Ucn, via physical interaction of activated protein kinase C ε with Kir6.1 KATP channel. In the third set of experiments, we explored the role of Ucn, and PKC isoforms epsilon and delta, in diabetic patients undergoing coronary bypass surgery In addition to inducing oxidative stress and negative inotropism in the heart, hyperglycemia, a powerful activating signal for cardiac PKC isozymes, results in mitochondrial dysfunction, cytochrome-c release and apoptosis in cardiac myocytes. Activation of PKC δ has been reported in ventricular myocytes under hyperglycemic conditions. We performed assays of Ucn, PKC ε and PKC δ from tissue specimens obtained from two sequential biopsies taken from the right atrium of diabetic and non-diabetic patients undergoing on pump coronary artery bypass graft surgery at the start of grafting (internal control) and 10 minutes after release of the aortic clamp. Ucn induction was documented both at the mRNA and protein level in non-diabetic hearts, compared to diabetic hearts in which pre-cardioplegic Ucn levels were 50% lower and post-cardioplegic Ucn induction was not observed. In diabetic hearts, pre-cardioplegic levels of PKC-ε were 30% lower than those of non-diabetic hearts, and cardioplegic arrest was not associated with increased expression of PKC-ε mRNA. After cardioplegic arrest, there was no upregulation of total PKC-ε nor increase in PKCε phosphorylation. Instead, there was overexpression of total PKC-δ and enhanced PKC-δ phosphorylation. Mitochondrial relocation of PKC-ε was mainly detected in postcardioplegic samples from non-diabetic hearts whereas nuclear and mitochondrial translocation of PKC-δ was mainly documented in post-cardioplegic samples from diabetic hearts. Apoptosis, assessed by TUNEL staining, was over 2-fold higher in post-cardioplegic samples from diabetic than non-diabetic hearts. Enhanced PKCε/mitochondria co-localization was observed in viable myocytes showing Ucn-positive staining, with prevention of myocyte apoptosis by mitochondrial relocation of PKC-ε. Cardiac cells showing cytosolic positive staining for Ucn never exhibited nuclear relocation of PKC-δ. In contrast, myocytes exhibiting nuclear relocation of PKC-δ were TUNEL-positive and systematically Ucn-negative, with induction of myocyte apoptosis by nuclear/mitochondrial relocation of PKC-δ. In summary, absence of cardioplegic arrest-induced myocyte overexpression of Ucn I in diabetic hearts was associated with induction, activation, nuclear and mitochondrial relocation of PKCδ, finally resulting in apoptosis. The failure to overexpress Ucn may render the diabetic heart more susceptible to apoptosis and contribute to adverse outcomes.