Scleroderma lung disease and β-thymosins:bronchoalveolar lavage fluid biomarkers

Obiettivi. Le β timosine sono un gruppo di piccoli peptidi con una massa molecolare di 5 kDa. Queste chemochine sono coinvolte nella polimerizzazione intracellulare dell’actina, ma possiedono anche numerose funzioni extracellulari e svolgono un ruolo nell’angiogenesi e nell’infiammazione. In particolare la timosina β4 (Tβ4) è un peptide ubiquitario essenzialmente intracellulare e strettamente coinvolto nella regolazione del citoscheletro inquanto è deputato a sequestrare l’actina monomerica o a rilasciarla in caso di polimerizzazione. La Tβ4 esercita, inotre, importanti funzioni regolatorie sia a livello intracellulare (i.e. signaling) sia a livello extracellulare (proprietà antinfiammatorie, proprietà favorenti la guarigione delle ulcere e l’angiogenesi). Esiste una forma sulfossidata della Tβ4, la sTβ4. La timosina β10 (Tβ10) è invece prodotta in corso di precancerosi, cancro ed infiammazione ed ha un’azione antiangiogenetica ed è coinvolta nella modificazione della motilità cellulare. Recentemente è stata descritta la presenza delle Tβ nella saliva di soggetti sani e nel fluido crevicolare gengivale utilizzando la RP-HPLC-ESI-MS. L’obiettivo di questo studio è stato quello di valutare l’eventuale presenza delle Tβ in un altro liquido biologico, il broncolavaggio alveolare (BAL) di soggetti sani e di soggetti affetti da sclerodermia con impegno polmonare. Inoltre, per individuare un marcatore di coinvolgimento polmonare in corso di sclerodermia sono stati studiati i livelli della Tβ4, sTβ4 e della Tβ10 e le loro reciproche variazioni in pazienti con e senza alveolite al BAL. Infine le concentrazioni delle Tβ sono state correlate al coinvolgimento funzionale e radiologico del polmone. Dato il ruolo delle β timosine nell’angiogenesi e la loro capacità di modulare il VEGF (vascular endothelial growth factor), anche i livelli di VEGF sono stati studiati nel BAL. Metodi. 15 controlli sani e 46 pazienti affetti da sclerodermia sono stati sottoposti a broncoscopia e i BAL ottenuti sono stati analizzati con un metodo proteomico. I pazienti affetti da sclerodermia sono inoltre stati sottoposti alle prove di funzionalità respiratoria e alla TAC ad alta risoluzione del polmone al basale e dopo 12 mesi. Le Tβ nel BAL sono state identificate mediante RP-HPLC-ESI-MS, mentre i livelli di VEGF sono stati valutati con metodica ELISA. Risultati. I livelli di Tβ4 sono risultati significativamente più elevati nei pazienti affetti da sclerodermia (0.310 +/- 0.372 µmol/L), rispetto ai controlli (0.112 +/- 0.084 µmol/L), p=0.008. Considerando i pazienti affetti da sclerodermia i livelli di sTβ4 erano significativamente più elevati nei pazienti con alveolite (0.025 +/- 0.052 µmol/L), rispetto ai pazienti senza alveolite (0.006 +/- 0.022 µmol/L), p=0.05. Ventiquattro pazienti (52.2%) presentavano un’alveolite al BAL. I pazienti che presentavano, dopo un anno di follow-up, un peggioramento dello score alveolare avevano livelli di Tβ4 più bassi. I livelli di sTβ4 correlavano con la percentuale di neutrofili al BAL (r=+0.36, p=0.013). Sebbene i livelli di Tβ10 fossero più elevati nei pazienti con sclerodermia rispetto ai controlli questa differenza non era statisticamente significativa. Inoltre vi era una correlazione indiretta tra i livelli di Tβ10 e la DLCO nei pazienti con sclerodermia (r=-0.39, p=0.009). Sono stati inoltre evidenziati nel BAL livelli significativamente più bassi di VEGF nei pazienti sclerodermici rispetto ai controlli sani, ed in particolare nei pazienti con alveolite rispetto ai pazienti senza alveolite. Conclusioni. In questo studio per la prima volta sono stati studiati la presenza e i livelli di Tβ (Tβ4, sTβ4 e Tβ10) nel BAL di soggetti sani e in pazienti sclerodermici con impegno polmonare. Mentre la Tβ4 è costitutivamente espressa nel polmone, la sTβ4 e la Tβ10 sono espresse solo in alcuni pazienti e in alcuni controlli sani. Gli elevati livelli di Tβ4 nei pazienti sclerodermici rispetto ai controlli suggerisce la Tβ4 come un possibile marcatore di patologia; mentre le diverse concentrazioni di sTβ4 nei pazienti con alveolite rispetto ai pazienti senza alveolite suggeriscono che questa molecola sia un possibile biomarcatore di stress ossidativo e di danno polmonare, vista anche la correlazione tra i livelli di sTβ4 e la percentuale di neutrofili. La correlazione tra i livelli di Tβ10 e la DLCO, invece, suggerisce un possibile ruolo inibitorio della Tβ10 sulla permeabilità alveolo-capillare. Quindi questi risultati indicano un possibile coinvolgimento di questi piccoli fattori paracrini nella patogenesi della malattia sclerodermica e che la Tβ4 possa avere un ruolo cito-protettivo nel danno tissutale del coinvolgimento polmonare sclerodermico. La presenza del prodotto di ossidazione della Tβ4, la sTβ4, sembra invece rispecchiare la presenza di uno stato infiammatorio, caratteristico dell’alveolite. I bassi livelli di VEGF nel BAL dei pazienti con alveolite sclerodermica confermano il possibile ruolo del VEGF nel mantenere l’omeostasi alveolo-capillare del polmone e la correlazione inversa tra il VEGF e la sTβ4 è suggestivo del ruolo contrapposto delle due molecole nel processo alveolitico.

Objective. The role of β-thymosins (Tβ4, Tβ4 sulfoxide [sTβ4], Tβ10) in cytoscheleton rearrangement, angiogenesis, fibrosis and reparative process suggests a possible involvement of these peptides in the pathogenesis of systemic sclerosis (SSc). The aims of the study were to demonstrate the presence of Tβ4, sTβ4 and Tβ10 in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of SSc patients with interstitial lung disease (ILD) and to correlate their levels with the biologic, functional and radiological parameters of the lung involvement and to the progression of ILD. Considering the role of β-thymosins in the angiogenetic process and in modulation of vascular endothelial growth factor (VEGF) production, also the VEGF BAL levels were investigated. Patients and Methods. Tβ4, sTβ4, Tβ10 were determined by HPLC-ESI-MS in BALF samples of 46 SSc patients with ILD and of 15 control subjects. VEGF levels were evaluated by ELISA. Results. Tβ4 levels were significantly higher in SSc patients than in controls (SSc: 0.310 +/- 0.372 µmol/L vs controls: 0.112 +/- 0.084 µmol/L, p=0.008). Nevertheless, lower BALF Tβ4 levels were found in the SSc patients with significantly worsening in the alveolar score on HRCT after one-year follow-up. In SSc cohort, patients with alveolitis presented higher BAL levels of sTβ4 (0.025 +/- 0.052 µmol/L) than SSc patient without alveolitis (0.006 +/- 0.022 µmol/L), p=0.05. Higher sTβ4 BALF levels correlated with the smoking habits, the presence of alveolitis, the BALF neutrophil percentage count, an inverted BALF CD4/CD8 ratio, and a lower forced vital capacity. Tβ10 levels directly correlated with the BALF lymphocyte percentage count and inversely with the carbon monoxide diffusing capacity. Furthermore SSc patients presented lower BAL VEGF levels compared to controls, principally the SSc patients with alveolitis. Conclusion. In this study for the first time the presence of Tβ4, its sulfoxide form and Tβ10 in human BALF has been described and the results suggested the possible involvement of these paracrine factors in the pathogenesis of scleroderma lung disease. As described in other studies, Tβ4 seems to have a protective role against tissue damage even in SSc lung disease and its oxidation product sTβ4 seems to mirror the presence of an inflammatory condition. The correlation between Tβ10 and DLCO suggests an inhibitory role of Tβ10 in the alveolar capillary permeability, while the inverse correlation between VEGF levels and sTβ4 levels implies a opposite role of these two molecules.