Effetto sinergico della gemcitabina e degli inibitori della istone deacetilasi (HDAC) nel ridurre la crescita cellulare in vitro e in vivo dell'adenocarcinoma duttale del pancreas

L’adenocarcinoma duttale del pancreas (ADP) è una delle neoplasie umane dal comportamento più aggressivo, caratterizzata da una prognosi estremamente infausta ed una sopravvivenza a 5 anni inferiore al 5% [1]. Questa situazione è strettamente legata alle difficoltà diagnostiche, all’aggressività del tumore, alla precocità delle metastasi ed alla resistenza a quasi tutte le classi di farmaci citotossici [1]. Al momento la gemcitabina (GEM; 2’,2’-diflorodeossicitidina; dFdC) [2,3] è considerato il chemioterapico più attivo contro l’ADP, ma anche tale farmaco raggiunge una risposta effettiva inferiore al 20% negli studi clinici [4]. I meccanismi di farmacoresistenza sono considerati uno dei maggiori limiti della GEM nel trattamento dell’ADP [5]. La GEM entra nella cellula attraverso un sistema di trasporto nucleosidico [6,7], viene fosforilata in dFd-CMP dalla deossicitidina chinasi (dCK) e quindi nuovamente fosforilata da una monofosfo- e difosfo-pirimidina chinasi nei derivati attivi 5’-difosfato (dFd-CDP), che inibisce la ribonucleotide riduttasi (RNR), e trifosfato (dFd-CTP), che entra in competizione con il dCTP per l’incorporazione nel DNA [8]. Una volta incorporato nel DNA, viene inserito un nucleoside naturale addizionale che previene i danni nucleari determinati dalla riparazione del DNA [9]. L’inattivazione della GEM può avvenire con un processo di deaminazione catalizzato dalla citidina deaminasi (CDD), che converte la GEM nel suo metabolica inattivo dFd-U, o di defosforilazione catalizzato dalla 5’- nucleotidasi citoplasmatica (5NT) che converte la dFd-CMP in GEM, impedendo così la produzione della forma attiva [10,11]. Sono stati descritti diversi meccanismi di resistenza alla GEM. Un primo meccanismo consiste in un’insufficiente concentrazione intracellulare di derivati attivi della GEM, che può verificarsi in caso di insufficiente uptake cellulare legato ad una bassa espressione di trasportatori nucleosidici (NTs) [12], livelli ridotti dell’enzima attivante dCK o elevati degli enzimi inattivatori CDD o 5NT [11,13,14]. Un secondo meccanismo di resistenza dipende da una perdita di sensibilità della RNR nel meccanismo di inibizione della GEM [15]. Anche un’alterazione dei geni regolatori dell’apoptosi, quali la p53 [16], che induce specificatamente nelle cellule una risposta di tipo apoptotico ai farmaci che danneggiano il DNA, può esser coinvolta nella resistenza alla GEM. E’ stato infatti dimostrato che le cellule di ADP, che presentano un elevato livello di mutazione del gene della p53 [17], incrementano notevolmente la loro sensibilità alla GEM dopo reintroduzione del gene p53 “wild type” [18]. Inoltre, una resistenza alla GEM può anche derivare da un’aumentata espressione della selenoproteina P, che è stata riconosciuta in grado di sopprimere i radicali liberi intracellulari, che sono almeno in parte responsabili dell’azione citotossica della GEM [19]. Gli inibitori della istone deacetilasi (HDAC) favoriscono l’iperacetilazione dell’istone ed inducono una marcata apoptosi nelle cellule tumorali p53-positive e p53-negative [20,21]. Benché il meccanismo di induzione dell’apoptosi da parte degli inibitori della HDAC sia stato compreso solo marginalmente, un’alterata espressione di alcuni geni apoptotici sembra rivestire un ruolo chiave [20,22]. E’ stato recentemente dimostrato che la tricostatina A (TSA), un inibitore della HDAC, induce apoptosi ed arresto del ciclo cellulare in fase G2 nelle linee cellulari di ADP [21]. Abbiamo quindi valutato gli effetti di un trattamento combinato con TSA e GEM sulla crescita delle cellule di ADP, sia in vitro che in vivo. In questo studio ci proponiamo di verificare: se la TSA aumenta significativamente l’inibizione della crescita indotta dalla GEM in quattro linee cellulari di ADP, tutte difettive per il gene p53 [17]; se l’eventuale potenziamento dell’effetto inibitorio sia strettamente associato con un incremento di induzione dell’apoptosi e una diminuzione del potenziale di membrana mitocondriale; se questi eventi siano correlati con l’induzione di stress ossidativi da parte della GEM e l’aumento dell’espressione dei geni apoptotici mitocondriali nei confronti dei geni antiapoptotici mediato dalla TSA [23]; infine se il trattamento combinato inibisce significativamente, rispetto ai singoli trattamenti, la crescita di ADP impiantato nei topi nudi.

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